微透析技术研究蒙脱石镶嵌盐酸倍他洛尔微球混悬液在兔眼房水的药动学

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2024年5月3日发(作者：)

微透析技术研究蒙脱石镶嵌盐酸倍他洛尔微球混悬液在兔眼房

水的药动学特征

蒋阿梅;李娟;韩鑫玥;赵雅文;刘朔;杨帆;吕竹芬;陈燕忠;平其能;侯冬枝

【摘 要】目的建立微透析技术的体外回收率测定方法,并考察体外回收率的影响因

素,并进一步将微透析技术应用到蒙脱石镶嵌盐酸倍他洛尔微球(Mt-BH-MPs)混悬

液在兔眼房水的药动学评价。方法采用浓度差法对各影响因素在体外回收率的高低

进行评价,同时利用反向透析法对2.8 mg/m L Mt-BHMPs混悬液在眼部给药后进

行房水取样,以高效液相色谱法测定其药物浓度。结果正、反向透析法测定的回收

率在同一流速下基本一致(RSD均小于2%),且探针回收率随流速增加呈下降趋势;

正、反向透析法所得的回收率在同一浓度下均很接近(56.22%,55.06%);Mt-BH-

MPs混悬液的生物利用度最高,其AUC(2 326.77±29.29)(μg·min)/m L分别是

BH水溶液组的3.12倍与贝特舒组的1.27倍,Cmax(8.56±0.26)μg/m L明显高于

贝特舒组(7.48±0.18)μg/m L和BH水溶液组(7.05±0.16)μg/m L,Tmax是BH水

溶液组的4倍,与贝特舒组一致,持续释药时间是BH水溶液组的2倍。结论连续取

样微透析技术用于该新型离子交换微球混悬液的眼部药动学研究方法可行,相较于

BH水溶液和贝特舒,Mt-BH-MPs混悬液缓慢释放药物,提高了药物在眼部的生物

利用度。

【期刊名称】《广东药科大学学报》

【年(卷),期】2019(000)003

【总页数】6页(P327-332)

【关键词】盐酸倍他洛尔;微透析;回收率;房水;药动学;微球

【作 者】蒋阿梅;李娟;韩鑫玥;赵雅文;刘朔;杨帆;吕竹芬;陈燕忠;平其能;侯冬枝

【作者单位】[1]广东药科大学药学院/广东省局部精准递药制剂工程技术研究中心

/广东省药物新剂型重点实验室,广东广州510006;[1]广东药科大学药学院/广东省

局部精准递药制剂工程技术研究中心/广东省药物新剂型重点实验室,广东广州

510006;[1]广东药科大学药学院/广东省局部精准递药制剂工程技术研究中心/广东

省药物新剂型重点实验室,广东广州510006;[1]广东药科大学药学院/广东省局部精

准递药制剂工程技术研究中心/广东省药物新剂型重点实验室,广东广州510006;[1]

广东药科大学药学院/广东省局部精准递药制剂工程技术研究中心/广东省药物新剂

型重点实验室,广东广州510006;[1]广东药科大学药学院/广东省局部精准递药制剂

工程技术研究中心/广东省药物新剂型重点实验室,广东广州510006;[1]广东药科大

学药学院/广东省局部精准递药制剂工程技术研究中心/广东省药物新剂型重点实验

室,广东广州510006;[1]广东药科大学药学院/广东省局部精准递药制剂工程技术研

究中心/广东省药物新剂型重点实验室,广东广州510006;[2]中国药科大学药学院,

江苏南京210009;[1]广东药科大学药学院/广东省局部精准递药制剂工程技术研究

中心/广东省药物新剂型重点实验室,广东广州510006

【正文语种】中 文

【中图分类】R965

兔子的眼部与人类具有相似的生理解剖结构[1]，且其房水能客观地反映眼内药物

的浓度变化,故通常作为眼用制剂药动学的首选考察样品[2]。在药物眼内动力学研

究中,通常采用前房和(或)玻璃体单次取样，绘制一条完整的具有统计学意义的眼部

动力学曲线需要大量的动物[3-4]，且基于非连续性的样本集合，药动学曲线误差

较大[5]；同时，眼部复杂的生理解剖结构以及局部较低的药物浓度等因素增加了

眼部取样的难度[6]。

眼部微透析是一种以渗透为原理的新型眼生物生化采样技术，用探针实现组织液中

的药物透过透析膜与灌注液进行扩散交换[7],对房水药物浓度进行实时监测，实现

对透析液成分在线定性及定量分析[8],且微透析取样技术排除了麻醉和蛋白结合等

因素对药物测定的影响，实验动物数量大大减少[9]。本研究在之前研究基础[10-

11]上，采用乳化-溶剂挥发法[12]，以盐酸倍他洛尔(Betaxolol Hydrochloride，

BH)为模型药物制备蒙脱石离子交换微球(Mt-BH-MPs)滴眼液，并采用微透析技

术对该新型载体滴眼液在兔眼房水中的药动学行为进行评价。

1 材料与仪器

由南方医科大学实验动物中心提供的普通级家兔，动物合格证号：

SCXK(粤)2012—0015；雌雄兼用，体质量2.0～2.5 kg。

SPD-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；PHS-3C pH计(上海雷磁仪器厂)；线

性探针(美国BASi公司)；单通道注射泵(美国BASi公司)；2.5 mL注射器(美国

BASi公司)；电子天平(德国Sartorius公司)。

贝特舒滴眼液(批号：15E20DA，比利时爱尔康公司)；盐酸倍他洛尔(批号：

JNHH121101，济南浩化公司)；Mt-BH-MPs混悬液(实验室自制)；盐酸奥布卡

因滴眼液、盐酸左氧氟沙星[参天制药(中国)有限公司]；组织胶水(美国3M

Vetbond公司)；甲醇(色谱纯，美国BCR)；乙腈(色谱纯，美国BCR)；NaCl(分

析纯，天津大茂化学试剂厂)；H3PO4(分析纯，天津市百世化工有限公司)；三乙

胺(分析纯，天津大茂化学试剂厂)；蒸馏水(屈臣氏集团有限公司)。

2 方法与结果

2.1 Mt-BH-MPs以及Mt-BH-MPs混悬滴眼液的制备

在本课题组前期研究[13-14]的基础上，以优化处方制备载药蒙脱石：内相O1相

为含有一定量的聚丙烯酸树脂、柠檬酸三乙酯、Acid-Mt-BH、甘油、吐温-80、

BH的乙腈溶液，外相O2相为含有一定量的液体石蜡与司盘-80的混合液。将内

相O1缓慢滴加到外相O2中，冰水浴(5～10 ℃)超声乳化15 min，室温下800

r/min磁力搅拌乳化90 min后，将转速调为650 r/min，搅拌至有机溶剂挥发完

全，待溶液澄清，用正己烷固化清洗，抽滤，晾干得Mt-BH-MPs。将适量的Mt-

BH-MPs、甘露醇、吐温-80加入质量浓度0.15%的卡波姆934P水溶液中，以均

质机分散均质，并以适量NaOH溶液调节pH为7，即得药物质量浓度为2.8

mg/mL的Mt-BH-MPs混悬滴眼液。

2.2 微透析技术在兔眼房水中的体外回收率考察

体外回收率有两种测定方法，一种是增量法[15](即正向透析法,RR)，一种是减量

法[16](即反向透析法,RL)。

增量法：将线性探针置于质量浓度为6 μg/mL的BH-生理盐水溶液中，用空白生

理盐水以2 μL/ min的流速灌流探针。收集6份微透析样品，HPLC 法测定其浓

度，并按公式(1)计算相对回收率：

RR=C透析/C×100%。

(1)

式中：RR为正向微透析法测得的相对回收率，C透析为流出的透析液中BH浓度；

C为灌流液中BH浓度。

减量法：将线性探针置于空白生理盐水中，用6 μg/mL的BH-生理盐水的标准溶

液以2 μL/min的流速灌流探针。收集6份微透析样品，HPLC 法测定其浓度，并

按公式(2)计算相对回收率：

RL=(C灌流-C透析)/C灌流×100%。

(2)

式中：RL为反向微透析法测得的相对损失率，C透析为流出的透析液中BH浓度，

C灌流为灌流液中BH浓度。

2.2.1 温度对BH体外回收率的影响 由于温度升高，分子热运动也随之增加，导致

物质扩散进入膜中的几率增加，在其他条件不变情况下探针的回收率提高。由于本

研究主要测定兔眼房水内药物浓度的变化，房水温度大致在34 ℃，故在体外回收

率考察过程中选择34 ℃进行试验。

2.2.2 灌流流速对BH体外回收率的影响 探针的灌流速度是影响回收率大小的重要

因素之一，流速越小，灌流液经过半透膜的时间越长，越有利于膜内外药物充分交

换，回收率越高。正、反透析方法考察流速对体内外回收率的影响时，灌流速度依

次设定为1.25、2.0、2.5、3.75 μL/min，每种流速下收集6份透析样品，按相应

公式计算回收率。

由图1可见，正(RR)、反(RL)透析法测定的回收率在同一流速下基本一致，且探针

回收率随流速增加呈下降趋势。综合考虑，在体动物试验时的灌流速度确定为2

μL/min。

图1 灌流速度对BH体外回收率的影响

Figure 1 The influence of flow rate on BH in vitro recovery

2.2.3 BH质量浓度对BH体外回收率的影响 精密配制2、4、6、8、10 μg/mL的

BH-生理盐水标准溶液，按“2.2.1”项下增量法、减量法考察BH质量浓度对体内

外回收率的影响，收集6份透析样品，结果见图2。可见，正(RR)、反(RL)透析所

得的回收率在不同浓度下均很接近，表明探针的回收率在2～10 μg/mL稳定，其

大小与药物的质量浓度无关，即可以认为灌流液浓度对微透析探针的回收率基本上

没有影响。

图2 BH质量浓度对体外回收率的影响

Figure 2 The influence of concentration on BH in vitro recovery

2.2.4 体外回收率的稳定性 探针通常会在微透析实验中连续使用数小时，若在实验

过程中，探针的回收率发生变化，则会失去微透析技术本身的意义，因此很有必要

考察回收率的稳定性[17]。按“2.3.1”项下正、反透析法，从0时开始收集微透

析样品，每隔30 min收集1个样品，持续12 h，计算体外回收率及其RSD值，

结果见图3。可见，探针回收率在0～1 h呈下降趋势；从2 h开始，回收率稳定

在一定范围内，正(RR)、反(RL)回收率分别为56.22%、55.06%，RSD%分别为

1.89%、1.16%(n=20)；且正、反透析法回收率的变化相似。

图3 BH体外回收率的稳定性Figure 3 Stability of BH in vitro recovery

2.3 微透析技术测定Mt-BH-MPs在兔眼房水中的药物浓度

2.3.1 探针植入 选取9只眼部正常、体质量为2～2.5 kg的健康家兔，雌雄兼用，

将家兔随机分成3组，分别为Mt-BH-MPs混悬液组、BH水溶液组、市售贝特舒

组。为预防眼部发生炎症，手术前3 d，每天给予兔眼左氧氟沙星滴眼液，早晚各

1次。在探针植入前4 h和0.5 h，分别给家兔耳缘静脉注射100 U/kg肝素钠，

以防止手术炎症反应引起的前房内纤维生成。给家兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠

(剂量30 mg/kg)使其麻醉，同时滴1滴盐酸奥布卡因滴眼液于眼表进行局部麻醉。

待家兔完全麻醉后将其侧卧固定于解剖台上，用开睑器撑开眼睑，在角巩膜边缘处

以26 G针头做贯通性刺穿，微透析探针沿针头腔内穿出，抽去针头，调整探针的

位置使探针全部浸入房水中，探针两端用组织胶水固定(如图4)。为防止感染，在

创口处滴入左氧氟沙星滴眼液，待创口完全愈合且房水充盈后，立即开始体内药动

学试验。

图4 微透析探针植入眼前房的示意图

Figure 4 Schematic of microdialysis probe implanted in anterior chamber

2.3.2 体内回收率的测定及其稳定性 在体内微透析实验中，由于探针外部的药物浓

度是未知的，因此一般是通过反向透析法测定药物经过半透膜时的流失量来间接计

算探针的回收率[18]。将探针植入家兔眼内房水后，立即以低流速的生理盐水进行

灌流，确保探针处于湿润的环境以保证其回收率。当创口完全愈合且前房充盈后，

以2 μL/ min的流速用6 μg/mL的BH-生理盐水的标准溶液灌流探针。从时间0

时开始收集微透析样品，每隔30 min收集1个样品，持续12 h，按公式(2)计算

回收率，结果见图5。

可见，在0～1 h，探针回收率呈下降趋势；在2～12 h，回收率在一定范围内保

持稳定，反透析法(RL)的回收率为28.90%，RSD 为2.32%(n=20)。传统的微透

析灌流速度在0.5～2.0 μL/min，小分子物质的相对回收率一般在10%～40%[19]，

本研究结果的RL法回收率在此范围内。

图5 BH体内回收率的稳定性Figure 5 Stability of BH in vivo recovery

2.3.3 微透析试验 以2 μL/min的生理盐水灌流2 h后，在家兔的结膜囊内分别给

予Mt-BH-MPs混悬液、BH水溶液、市售贝特舒，每次分别给予50 μL，1 min

内给予2次，以给药完成时刻为0时开始计时，每隔30 min收集样品，持续10

h。将收集的样品置于4 ℃冰箱中保存，24 h内完成测定。

将微透析样品测得的BH峰面积代入标准曲线，计算给药后各时间点家兔房水中的

药物浓度，绘制房水药时曲线见图6；采用软件3p87计算AUC等房水药动学参

数，结果见表1。

图6 家兔房水给药100 μL微透析浓度-时间曲线

Figure 6 Aqueous humor BH concentration-time profiles following a 100

μL topical dose in rabbits

表1 BH在家兔房水中的药动学参数Table 1 Pharmacokinetic parameters of

BH in rabbit aqueous humor 药物AUC/(μg·mL-1·min)Cmax/(μg·mL-

1)Tmax/mint1/2/minBH水溶液745.76±35.827.05±0.163078.05±5.14Mt-

BH-MPs2 326.77±29.298.56±0.26120222.99±14.63贝特舒1

938.98±32.987.48±0.18120163.25±12.07

可见，生物利用度由高到低次序为Mt-BH-MPs>贝特舒>BH水溶液。BH水溶液

组在给药后30 min时，药物质量浓度迅速达到峰值7.05 μg/mL；体外释放性能

研究表明，BH水溶液在2 h累积释放100%，在120 min时药物质量浓度仅为

1.87 μg/mL，随后又持续减少，仅300 min后，房水中药物质量浓度已低于检测

限。Mt-BH-MPs组给药后120 min时，房水中药物质量浓度达到峰值8.56

μg/mL，随后药物缓慢释放，作用效果持续到600 min，作用时间是BH水溶液

的2倍。市售贝特舒与Mt-BH-MPs房水中药物浓度变化趋势基本一致，同样在

给药后120 min时，房水中药物质量浓度达到峰值7.48 μg/mL，随后药物浓度

减少，在600 min后低于检测限。随着时间的延长，Mt-BH-MPs组在420 min

后药物质量浓度是贝特舒组的2倍，明显高于贝特舒组。从表1可见，Mt-BH-

MPs组的AUC(2 326.77±29.29)(μg·min)/mL分别是BH水溶液组的3.12倍与

贝特舒组的1.27倍，Cmax(8.56±0.26)μg/mL明显高于贝特舒组

(7.48±0.18)μg/mL和BH水溶液组(7.05±0.16)μg/mL，Tmax是BH水溶液组的

4倍，与贝特舒组一致。综上所述，Mt-BH-MPs明显提高了制剂的眼部生物利用

度。

3 讨论

探针回收率是微透析研究的关键，待测物的分子大小、脂溶性、蛋白结合率等，探

针的有效膜长度、截流分子量等，灌流液的灌流速度、温度、亲水性等，都会影响

回收率[20]。本文结果显示，在不同浓度下，正(RR)、反(RL)透析所得的回收率均

很接近，表明探针的回收率在0.1～10 μg/mL内稳定，其大小与药物的浓度无关；

正(RR)、反(RL)透析法测定的回收率在同一流速下基本一致，且探针回收率随流速

增加呈下降趋势。低流速有利于提高回收率，但采样时间会延长，导致微透析的时

间分辨率降低而丢失浓度变化信息，因此选取的灌流速度需兼顾采样量和回收率，

最终确定为2.0 μL/min。稳定性考察中，探针回收率在0～1 h呈下降趋势，从2

h开始，正、反微透析的回收率均稳定在一定范围，故每次微透析实验需先平衡探

针2 h，以确保微透析实验可持续进行。

微透析实验中，由于BH水溶液渗透性强、表观系数大，易透过角膜进入房水，且

其刺激性强，家兔眨眼等使滴入的药液迅速从结膜囊溢出或从泪液中流失导致进入

房水中的剂量减小，因此房水药物浓度迅速下降；而Mt-BH-MPs混悬液中微球

能在眼穹隆中滞留，且将盐酸倍他洛尔载药于Mt后，当其在角膜前释放时，由于

吸附于蒙脱石层间的倍他洛尔阳离子可被角膜前泪液中的Na+和K+置换出来，进

入角膜细胞的倍他洛尔在角膜中酶的作用下使药物持续释放，故可提高制剂的生物

利用度。

本研究用微透析技术考察Mt-BH-MPs混悬液的制剂药动学，效果良好。

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本文标签： 透析回收率药物探针浓度