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2024年6月19日发(作者：)

的区域的RNA通过基于标准RT的方法回收，随后扩增。通过产

定向克隆入表达载体的适合DNA片段的巢式引物PCR扩增进行

轻链：HindIII/BsiWI和重链：HindIII/XhoI。用于此回收过

列从宿主动物基因组的序列分析中得到。新型序列的主

以及小鼠和大鼠。引物序列为：

生用于

步骤2：

程的特异性序

要来源是兔，

<

entry> 引物

TC

部

GC

SEQ ID NO 序列(5′至3′)

Vk有义外部

1

AG[GA]ACCCAGCATGGACA[CT][CGA]A

Vk有义内部 2

GATATCAAGCTTCGAAATCGACATGGACACGA

CCC(HindIII/SfuI)

3 Ck反义外部

GGGCC

GGA[TC][AG]G[AT]ATTTATT[CT]GCCAC[GA]CACA

Ck反义内部 4

TCTAGACGTACGTTTGACCACCACCTCGGTCCC

(BsiWI)

5

VH有义外

AGAC[AG]CTCACCATGGAGACT

VH有义内部 6

GATATCAAGCTTACGCTCACCATGGAGACTGG

(HindIII)

Cg CHl

反义外部 7

ACTGGCTCCGGGAGGTA

Cg CHl

8

CGCGCGCTCGAGACGGTGACSAGGGTSCCYKG

反义内部

GCC

CC(XhoI)

哺乳动然后将克隆的cDNA连接入能表达重组轻链和重链的两个不同的

物表达载体(κ轻链恒定区和γ-1(γ-1)重链恒定区)。这些

并且并入包括于序列回收中的天然信号序列。

DNA制备，并且通过将两种质粒转染进入

兔/人嵌合抗体的瞬时产生。培养5天后，

且就抗原识别直接测试条件培养基，或经

力纯化重组抗体。

然后使用上述的ELISA方法就抗原识别测试抗体。此外，对于纯

构建体在框架中制备，

对各种表达质粒进行大规模

HEK293细胞，来进行全长

通过离心移除所得的细胞，

由蛋白质A色谱法而亲和

化的抗

体，通过ForteBio Octect测量而建立Kd。最终，测试归因于

用于轻链和重链序列回收的实验性方法

本方法基于制造商对Qiagen One Step RT-PCR试剂盒的说明中所

术。制备通常的主混合物(master mix)，并且其包括RNasin

防止RNA降解。将50μL包含0.58μM每步1个引物(引

述的技

与回收序列相关的特定孔的原始功能修饰特性。

(Promega)以

物

的冷冻SEQ ID NO：1、3、5和7)的RT-PCR主混合物添加至包含先前回收

细胞的250μl eppendorf管，并且在冰上小心混合。用下列循

步RT-PCR：(1)50℃，30分钟；(2)95℃，15分钟；

(4)54℃，30秒；(5)72℃，1分钟；(6)进入步

(7)72℃，3分钟；和(8)4℃，保持。

当这些循环结束时，使用1.5μL初次RT-PCR反应物在单独的反

行第二次PCR扩增以回收轻链和重链可变区域。使用下列循环

环方案进行一

(3)94℃，30秒；

骤3，共35个循环；

应中进

方案用

0.4μM第二巢式PCR引物轻链(引物SEQ ID NO：2和4)和重

SEQ ID NO：6和8)进行KOD聚合酶驱动的扩增(Novagen)：

钟；(2)94℃，30秒；(3)60℃，30秒；(4)72℃，

35个循环；(6)72℃，3分钟；和(7)4

在完成第二次扩增后，取出10μL反应物并且通过2％TAE琼脂

电泳来分析。剩余的40μL反应物经由Qiagen Qiaquick PCR

盒来纯化，并且洗脱成75μL。

随后使用下列条件消化这些扩增子(轻链用HindIII/BsiWI，重

HindIII/XhoI)：10μL纯化的PCR产物、3μL 10×New

性酶缓冲液2、0.5μL HindIII(5U)和0.5μ

下60分钟，然后在55℃下30

链(引物

(1)94℃，2分

45秒；(5)进入步骤2，共

℃，保持。

糖凝胶

Clean-up试剂

链用

England Biolabs限制

L BsiWI(5U)或0.5uL XhoI，在37℃

分钟。该消化物经由

连接入适合的表达载体。然Qiagen Qiaquick PCR方法来纯化。随后将这些

后2μL的这种反应物用于转化TOP10

并且将转化的细胞涂布在LB/

(Invitrogen)或XL-10(Stratagene)，

卡那霉素(50μg/mL)上。

使用下列引物经由PCR筛选方法就插入物筛选所得的克隆：

<

entry> 引物

SEQ ID NO 序列(5′至3′)

载体

9

GCGCGCCACCAGACATAATAGCT

重链 10

AGCCCAAGGTCACCGTGCTAGAG

轻链 11

GTATTTATTCGCCACACACACACGATG

挑选克隆放至60μL LB/卡那霉素，且温育高达30分钟。在30

约1μL，并用于包含2μM引物对(SEQ ID NO：9/10

分钟时，取出

用于重链和

应(Novagen)。扩增SEQ ID NO：9/11用于轻链)的标准30μL KOD扩增反

方案如下：(1)96℃，2分钟；(2)96℃，20秒； (3)68℃，25秒；(4)进入步

骤2，重复共40个循环；和(5)68℃， 2分钟。

取出5μL，且在2％琼脂糖上进行分析。在证实正确的可变区插入

5μL各种反应物在10μL终体积的New Biolabs限制性酶缓冲

Alul(New England Biolabs)进行消化，并且在4％TAE琼脂

进行分析。鉴定每个回收孔的独特Alu模式。随后对这些

序列表征。

物后，

液2中用

糖凝胶电泳上

进行处理用于

本文标签： 回收序列方法轻链进行

版权声明：本文标题：用于获得抗原特异性B细胞的克隆群体的培养方法 内容由热心网友自发贡献，该文观点仅代表作者本人， 转载请联系作者并注明出处：https://m.elefans.com/dianzi/1718809037a727968.html， 本站仅提供信息存储空间服务，不拥有所有权，不承担相关法律责任。如发现本站有涉嫌抄袭侵权/违法违规的内容，一经查实，本站将立刻删除。