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2023年12月19日发(作者：)

新冠病毒相关材料与考点

新型冠状病毒与SARS病毒都是依赖病毒表面的S糖蛋白与细胞表面的血管紧张素转换酶2（ACE2）的结合，侵染细胞，导致疾病的产生。

一、新冠病毒与中心法则

新冠病毒是一种以单股正链RNA（+RNA）作为遗传物质的RNA病毒，其遗传信息的传递过程如下图：

而HIV虽然也是一种RNA病毒，但它是一种逆转录病毒，遗传信息的传递过程如下图：

拓展：根据RNA能否直接起mRNA作用而分成单股正链RNA病毒(正股RNA病毒)与单股负链RNA病毒(负股RNA病毒)两种。

正股RNA病毒(如脊髓灰质炎病毒)的单股RNA可直接起mRNA作用，转译早期蛋白质，包括RNA多聚酶和抑制宿主细胞合成代谢的调控蛋白。负股RNA病毒(如正粘病毒、副粘病毒、弹状病毒)的单股RNA不能作为mRNA，称为负股，须先合成互补股(正股)作为mRNA，再转译蛋白分子，而後产生核酸的复制型，成为合成子代病毒RNA的模板。

二、新冠病毒检测

冠状病毒的检测有这样一些方法：(1) 核酸检测，即检测病毒的遗侍物质核酸; (2)特异性抗原蛋白检测，即检测病毒表面的一种糖蛋白；(3)特异性抗体检测，即检测感染者体内通过免疫反应所产生的某种抗体。如果检测RNA,也要用到PCR技术，当然需要先对RNA进行逆转录得到对应的 cDNA。如果检测抗原蛋白或对应抗体，会涉及抗原、抗体的特异性结合。

病毒核酸检测，其实就是对病毒的遗传物质RNA进行检测。而针对病毒RNA进行检测的技术，还可以分两种：一种是实时荧光RT-PCR，一种是病原宏基因组测序（mNGS）。它们都是用于诊断新冠病毒感染的方法。但核酸检测因为速度快（4~6小时）而应用更多，而基因测序比较慢（24~72小时），所以用的比较少。

一般对于高度疑似新冠病毒感染、但核酸检测是阴性的病人，会利用基因测序技术进一步确认。图为《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》试行第六版，新型冠状病毒肺炎确诊的病原学依据。

实时荧光RT-PCR检测是如何让病毒“显形”的？首先要采集样本。由于新冠病毒是通过呼吸道感染人体，所以样本要从呼吸道采集。目前常规的样本类型大致有2类：一类是用咽拭子、鼻拭子在人的上呼吸道（咽部或鼻腔）擦拭采集；另一类是收集下呼吸道痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等。采集到的样本将被严格封存，送到实验室。那里是检测员让病

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毒“现形”的战场。

【例题1】

答案：A

1.实时荧光RT-PCR

① 提取病毒的RNA。先从样本中提取出病毒的RNA。具体来说，就是在样本中加入核酸提取试剂，把病毒破坏，让核酸释放出来。提取病毒核算必须在高级别的生物安全柜内完成。

② 把病毒RNA“反转录”成cDNA。通过反转录技术（RT），把病毒的RNA“反转”成一种特异DNA，即cDNA（因为病毒RNA结构不稳定，所以把病毒RNA转换成稳定的cDNA会更方便检测）。这里会用到核酸检测试剂盒中一种叫“反转录酶”的物质。而完成转录后，所有工作都将围绕cDNA展开。

③ 进行cDNA的扩增与检测。简单说就是扩增cDNA的数量。这里应用的就是PCR，全称聚合酶链式反应。具体来说，就是借助试剂盒中一些特殊物质，让cDNA不断复制，使其数量呈指数式增长。所谓RT-PCR，就是将RNA的反转录（RT）和cDNA的扩增（PCR）相结合的技术。

当cDNA扩增的同时，试剂盒中还有一种叫荧光探针的东西同时工作。它会释放荧光信号，cDNA每完成一次扩增，荧光信号就会增加一点，而PCR检测仪就能记录到一个荧光信号增加的Ct值。

④ 出结果。这一步就是根据检测仪记录的Ct值，进行检测结果分析。理想状态下，如果样本中有新冠病毒，那么在cDNA完成预订次数的扩增后，检测仪记录的Ct值就会形成一个逐渐上升的S形曲线，检测结果为阳性；如果没有类似的S型曲线，检测结果就为阴性。

做完以上所有工作，通常需要4~6小时。

2.基因测序技术

病原宏基因组测序（mNGS），是针对病原微生物（细菌、真菌、病毒和寄生虫等）使用的基因测序技术。它的原理比较简单，首先，我们要掌握病毒的基因序列。（中国科学家在发现新冠病毒后5天就鉴定分析出了它的基因组序列，此处应有掌声！）然后是检测。在实

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验室里，技术人员利用基因测序仪器，针对样本中提取的病毒RNA或总核酸进行检测。当样本中检测出的病毒基因序列，与已知的新冠病毒基因序列高度同源，就可以确诊感染。

基因测序是一个更加复杂且耗时的过程，可以简单归纳为以下7个步骤：

①采集样本：与前面介绍一致。

②从样本中提取出病毒RNA：与前面介绍一致。

③把病毒RNA反转录为cDNA：为了便于检测，测序也需要进行反转录。

④文库构建：翻译过来，就是把完整的DNA链条打碎成片段，接着给DNA片段末端修复，然后给DNA片段加上独有的样本编码（用于识别这个样本是谁的），并把DNA片段用一个接头固定起来，方便测序……

⑤高通量测序：通过高通量测序仪，把文库的核酸序列检测出来。

⑥生物信息分析：把测出的DNA序列与已有的数据库进行比对。

⑦出具检测报告

这样一套完整的病毒基因测序流程，加上出结果，通常需要24~72小时。基因测序还有个特异功能：如果病人同时感染了多种病毒，基因测序也能够发现。病毒核酸检测过程极为严格，需要全程严格消毒，且工作人员全程三级防护（穿防护服，戴N95口罩、护目镜、双层手套、脚套）。因为这是在与病毒打交道。从采集样本到检测，每一个步骤都凶险万分，一不小心就有被病毒感染的可能。

三、预防新冠病毒感染的新思路

最近，《细胞》杂志以“提前公开”的形式，陆续发表了多篇关于新冠病毒的重要论文。近日，又有一篇论文以同样形式上线。在这篇论文里，一支跨国研究团队提出了一种预防新冠病毒感染的新思路。在缺乏有效治疗药物和预防疫苗的当下，这项研究的重要性不言而喻。

论文中指出，先前的多项研究均暗示ACE2在新冠病毒引起的疾病里，扮演了重要而复杂的角色。一方面，ACE2是新冠病毒进入细胞所识别的受体。在小鼠模型里，ACE2表达水平越高，疾病就会越严重；另一方面，ACE2还有一定的保护作用。如果ACE2表达水平很低，小鼠的肺部损伤就会更严重。

这些观察让研究人员们产生了一个大胆的想法——使用体外纯化的重组人类ACE2蛋白，能不能预防新冠病毒的感染？这背后的逻辑很简单：新冠病毒会识别并结合人类ACE2蛋白。从外部加入的这些蛋白就像磁铁一样，会把新冠病毒给“吸走”，让它们无法入侵细胞。这样一来，我们不就能削弱病毒的人体感染力了吗？

为了检验这个想法，研究人员们先是分离出了新冠病毒，再用它们去感染培养的细胞。有意思的是，如果病毒在感染细胞之前，先和重组人类ACE2蛋白接触30分钟，这些病毒的感染能力就会明显削弱。研究人员估计，削弱的幅度大约为1000-5000倍。相反，如果加入的是新冠病毒无法特异结合的鼠类ACE2蛋白，就无法起到抑制新冠病毒感染的效果。

在细胞实验取得积极成果之后，研究人员们在“类器官”模型里做了后续的研究。相较细胞模型，类器官能更好地反映器官的一些关键特征，从而具有更好的代表意义。

在肾脏类器官中，使用的人类重组ACE2蛋白浓度越高，抑制效果看似越明显。利用诱导多能干细胞技术，研究人员们得到了人类毛细血管和肾脏的类器官，并确认病毒会在其中进行复制。和先前细胞实验结果类似，加入重组的人类ACE2蛋白，均可显著减少新冠病毒

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的感染。在肾脏模型中，这种抑制能力还表现出了剂量相关性——加入的ACE2蛋白浓度越高，抑制能力就越好。而安全性的初步数据也表明，无论是毛细血管模型还是肾脏模型，体外加入的ACE2蛋白，都没有产生毒性。

在讨论环节，科学家们也指出该研究存在多个局限性。首先，这项研究针对的是病毒的早期感染阶段，目标是防止新冠病毒早期入侵宿主细胞。人类重组ACE2蛋白在病程后期是否还有抑制效果，是一个未知数；其次，本研究选取的毛细血管和肾脏类器官虽然在病理上有一定科学依据，但研究人员们并没有测试肺部类器官，而这是新冠病毒感染的重灾区；最后，在实际的生理环境下，ACE2相关的信号通路和调控网络更为复杂。我们还需要进行更多研究，才能知道额外添加的人类重组ACE2蛋白可能会产生哪些效果。

总结来看，作者们在论文里指出，这些结果表明可溶性的ACE2有望抑制新冠病毒，防止它们进入细胞。在各种“老药新用”迟迟得不到临床验证，疫苗又需要12-18个月才能诞生的当下，这项研究无疑带来了一种预防病毒感染的新思路。当然，仅凭这些细胞实验和类器官实验的结果，是远远不够的。为了验证它的预防潜力，我们还需要进行更多的探索。有意思的是，出于其他一些目的，纯化的人类重组ACE2蛋白在过去已经完成了1期和2期临床试验。这是一个良好的开端，我们也希望科学家们后续探索的时间不用太久。

四、其他知识点

1.冠状病毒和细胞膜上的结合位点ACE2结合从而入侵细胞说明细胞膜具有（进行信息交流）的功能，也说明细胞膜（控制物质进出）的功能是相对的。

2.直接参与子代病毒在细胞内的组装过程的结构有（核糖体，内质网，高尔基体，囊泡），提供能量的细胞器是（线粒体）。这说明了各生物膜（在结构和功能上紧密联系）。

3.子代病毒通过囊泡排出细胞说明生物膜具有的结构特性是（一定的流动性）。

4.合成的RNA聚合酶只对病毒所需RNA的合成起催化作用，说明酶具有（专一性）。RNA的效率明显高于无机催化剂，说明酶具有（高效性）。

5.人体通过促使被病毒感染的细胞凋亡从而清除病毒，这说明细胞凋亡有利于（维持生物内部环境稳定，抵御外界各种因素干扰）。细胞由于病毒的增殖而裂解死亡（不属于）细胞凋亡。

6.冠状病毒的+RNA进入细胞后，首先翻译为RNA聚合酶。这一过程需要的条件有（模版：冠状病毒的+RNA，原料：氨基酸，能量，酶，tRNA，rRNA），进行的场所是（核糖体）。这说明+RNA的作用最类似于人体的（mRNA）。

【例题2】冠状病毒为单股正链RNA病毒，用（+）RNA表示。下图表示冠状病毒的增殖和表达。相关说法错误的是（ ）

A．冠状病毒属于RNA病毒，体内含有逆转录酶

B．病毒RNA复制时需要的酶在宿主细胞内合成

C．病毒RNA可直接作为翻译的模板

D．病毒RNA复制时遵循碱基互补配对原则

【答案】A

7.正链RNA上结合多个核糖体的意义是（少量正链RNA可以迅速合成大量病毒所需的蛋白质）

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8.以+RNA为模板合成-RNA的过程所遵循的碱基互补配对法则与中心法则中的（翻译）过程相同。这一过程需要的条件有（模版：冠状病毒的+RNA，原料：四种游离的核糖核苷酸，能量，酶：RNA聚合酶）。

9.冠状病毒相对DNA病毒更容易发生变异，这是由于（RNA分子是单链，DNA分子具有双螺旋的双链结构，因此RNA比DNA容易发生碱基增添，替换和丢失）。

10.冠状病毒侵入人体后需要淋巴细胞和吞噬细胞消灭，淋巴细胞和吞噬细胞直接生活的内环境主要是（血浆和淋巴）。

11.冠状病毒主要通过呼吸道侵入人体。鼻腔中的黏膜和毛发属于保卫人体的（第一道防线）

12.冠状病毒进入人体后，吞噬细胞可以对其进行识别和吞噬。这属于（非特异性免疫），是人体的（第二道防线）。

13.冠状病毒病毒突破前两道防线后，引发人体特异性免疫反应的物质称为（抗原），如冠状病毒病毒表面的蛋白质。

14.吞噬细胞对冠状病毒进行摄取和处理后，将抗原呈递给T细胞。这说明吞噬细胞（既能参与特异性免疫，又能参与非特异性免疫）。

15.冠状病毒会入侵肺细胞，要将其完全清除需要经过（细胞免疫和体液免疫）过程。同时参与这两个过程的淋巴细胞是（T细胞）。

16.肺细胞被冠状病毒感染后，效应T细胞与肺细胞密切接触，使细胞裂解死亡。这（属于）细胞凋亡。

17.冠状病毒感染后，免疫系统对肺细胞的攻击引发肺炎。此时可以通过适度使用（免疫抑制剂）对病人进行治疗以避免肺部严重受损。

18.已被治愈的患者短期内不容易再次被冠状病毒感染，这是由于他们体内产生了（记忆细胞和抗体），当再次接触冠状病毒抗原时，可以迅速增殖分化为（浆细胞和效应T细胞）。

19.细胞因子风暴(cytokine storm)是指机体感染微生物后引起体液中多种细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等迅速大量产生的现象，是引起急性呼吸窘迫综合症和多器官衰竭的重要原因。免疫系统的日常工作是清除感染，但是如果大量的新冠病毒对人体产生攻击，免疫系统被激活到极限程度或者失去控制，它就会伤害宿主，极端的免疫攻击是"细胞因子风暴"。（新冠病毒引起人体产生自身免疫病）。埃博拉病毒感染的最后阶段，细胞因子风暴才是夺命杀手，像禽流感和非典之类的很多病毒都一样，能够触发免疫系统对身体的猛烈攻击。

【例题3】2020年初，武汉出现不明原因肺炎，经检测发现这场肺炎是由一种新型冠状病毒引起。请回答下列样问题：

(1)新型冠状病毒侵入人体内，首先要突破保卫人体的第一道防线和第二道防线，这两道防线人人都有，也不针对某一类特定病原体，因此叫做______免疫。

(2)新型冠状病毒侵入人体后寄生在宿主细胞中，_____能识别被寄生的寄主细胞，并与之密切接触，使其裂解死亡；新型冠状病毒被释放出来，而后会被_____(填“细胞”或“体液”）免疫产生的_____所凝集，使之失去侵染能力，最后被吞噬细胞吞噬消化。

(3)当同种抗原第二次入侵人体时，_______会迅速增殖分化形成浆细胞，进而产生更快更强的免疫效应。

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【答案】(1)非特异性 (2) 效应T细胞 体液 抗体 (3) 记忆细胞

【例题4】人感染埃博拉病毒（EV）会引起致命的出血热。为了寻找治疗EV病的有效方法，中外科学家进行了系列研究

（1）EV表面的糖蛋白（EV-GP）作为______ 刺激机体产生______ 性免疫反应。

（2）科学家采集了多年前感染EV并已康复的甲、乙两人的血液，检测抗EV-GP抗体的水平。据图1，应选取______ 的血液分离记忆B细胞用以制备单克隆抗体（单抗）。

（3）将制备的多种单抗分与病毒混合，然后检测病毒对宿主细胞的感染率．根据图2，抑制效果最好的两种单抗是______ 。

（4）EV-GP具有多个与抗体结合的位点，为了研究上述两种单抗（分别称为A、B）与EV-GP结合的位点是否相同，可按图3所示简要流程进行实验。

①请将图3中应使用的抗体填入下表i、ii、iii、iv处（填“A”或“B”或“无关抗体”），完成实验方案（一种即可）。

②若A、B与EV-GP结合的位点不同，与对照组1、2分别比较，实验组的荧光值应______ 。

（5）中国科学家用分子结构成像技术证实了A、B与EV-GP结合的位点不同．基于上述系列研究，请你为治疗EV病毒提供两种思路______ 。

答案：（1）抗原 特异（2）甲（3）Ⅲ和Ⅴ

（4）①方案一：i．B ii．A iii．无关抗体 iv．A 方案二：i．A ii．B iii．无关抗体 iv．B

②与对照组1基本相同，且明显高于对照组2

（5）思路一：单独或共同使用A、B进行治疗 思路二：利用单抗制成靶向药物

思路三：针对EV-GP与抗体结合位点的结构研制新型药物

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本文标签： 病毒细胞检测