G蛋白耦联胆汁酸受体激动剂INT777通过激活AMPK信号通路抑制施万细胞成

6

・

南通大学学报(医学版

)

Journal

of

Nantong

University

(Medical

Sciences)

2021

:

41

(1)

D0I:10.16424/32-1807/r.2021.01.002

G

蛋白耦联胆汁酸受体激动剂

INT777

通过激活

AMPK

信号通路抑制施万细胞成髓鞘过程

*

关晋东

：

丁杰

，

刘晓宇

，

孙诚

***

(

南通大学教育部

/

江苏省神经再生重点实验室

/

神经再生协同创新中心

，

南通

226001)

［

摘

要］

目的

：

研究

G

蛋白耦联胆汁酸受体

(

G-protein-coupled

bile

acid

receptor

1,

GPBAR1,

同时也被称为

TGR5)

特异性激动剂

6

琢

-

乙基

-23(S)-

甲基胆酸

［

6

alpha-ethyl-23

(

S)-methylcholic

acid,

INT777

［

对原代施万细胞髓鞘形成的影响

并初步探讨其可能的作用机制遥

方法

:

用

5

滋

mol/L

的

INT777

处理二丁酰环腺苷酸

(dibutyryl

cyclic

adenoslne

phosphate,

dbcAMP

)

诱导分化原代施万细胞成髓鞘模型

，

用免疫印迹

(

Western

Blot

)

方法检测髓磷脂蛋白表达量的变化遥同时

，

提取

施万细胞总核糖核酸后用定量聚合酶链式反应试验检测

INT777

对髓鞘形成过程相关分子基因表达的影响遥另外

，

用

Western

Blot

方法检测

INT777

对单磷酸腺苷活化蛋白激酶

/

核糖体蛋白

S6

激酶

(adenosine

5

'

-monophosphate-activated

protein

kinase/ribosomal

S6

kinase,

AMPK/S6K)

信号途径的影响遥

结果

:

在

dbcAMP

诱导分化原代施万细胞成髓鞘过程中

，

5

滋

mol/L

INT777

的处理抑制了髓鞘早期生长因子

20,

八聚体结合转录因子

6,

髓磷脂蛋白的表达

，

且

5

滋

mol/L

INT777

处理激活了

AMPK

的活性

，

抑制了雷帕霉素作用靶点信号通路遥

结论

：

INT777

抑制

dbcAMP

诱导的施万细胞成髓鞘过

程

，

这种抑制作用可能是通过激活施万细胞

AMPK

活性

、

抑制

S6K

活性实现的遥

［

关键词

］

施万细胞曰髓鞘曰

6

琢

-

乙基-23(S)-甲基胆酸曰单磷酸腺苷活化蛋白激酶

［

中图分类号

］

R338.1

［

文献标志码

］

A

［

文章编号

］

1674-7887

(

2021

)

01-0006-05

G-protein-coupled

bile

acid

receptor

agonists

INT777

inhibits

myelination

of

Schwann

cells

by

activating

AMPK

signaling

pathway

GUAN

Jindong

**

,

DING

Jie,

LIU

Xiaoyu,

SUN

Cheng

***

*

(

'

Key

Laboratory

of

Neuroregeneration

of

Jiangsu

and

Ministry

of

Education,

Co-innovation

Center

of

Neuroregeneration,

Nantong

University,

Nantong

226001)

［

Abstract

］

Objective:

To

investigate

the

effects

of

G-protein-coupled

bile

acid

receptor

1(GPBAR1,

also

known

as

TGR5)

specific

agonist

6

alpha-ethyl-23(S)-methylcholic

acid(INT777)

on

myelination

in

primary

Schwann

cells

and

the

underlying

mechanisms.

Methods:

Primary

Schwann

cells

were

treated

with

5

滋

mol/L

INT777

and

dibutiryl

cyclic

adenoslne

phosphate

(dbcAMP),

and

the

changes

of

myelin

protein

zero

were

detected

by

Western

Blot.

Meanwhile,

the

total

RNA

was

extracted

from

Schwann

cells

and

quantitative

real

time

polymerase

chain

reaction

was

employed

for

detecting

myelin

gene

expression.

In

addition,

the

effect

of

INT777

on

the

adenosine

5

'

-monophosphate

-activated

protein

kinase/ribosomal

protein

S6

kinase

(AMPK/S6K)

signaling

pathway

was

examined

by

Western

Blot.

Results

:

Treatment

with

5

滋

mol/L

INT777

inhibited

the

expression

of

myelin

early

growth

response

-2,

octamer

-binding

transcription

factor

6,

and

myelin

protein

zero

during

dbcAMP-induced

myelination

of

differentiated

Schwann

cells,

and

treatment

with

5

滋

mol/L

INT777

activated

AMPK

activity

and

inhibited

mTOR

signaling

pathway.

Conclusion:

INT777

attenuates

dbcAMP-induced

myelination

of

Schwann

cells,

which

may

be

achieved

by

activating

AMPK

and

inhibiting

S6K

activity.

［

Key

words

］

Schwann

cell;

myelination;

6

alpha-ethyl

-23

(S)-methylcholic

acid;

adenosine

5'

-monophosphate-activated

protein

kinase

外周神经系统

(peripheral

nervous

system,

PNS)

在机体内分布广泛且起到介导靶器官与中枢神经系

统信号传递的重要作用

。

轴突的髓鞘化是神经系统

髓鞘形成这一重要任务由施万细胞完成

。

外周神经

髓鞘形成过程是一个严谨的

、

由多种转录因子参与

调控的复杂生理过程叫

这些转录因子包括

SRY

盒

传递神经冲动信号

，

执行其功能的基础保障,髓鞘化

过程异常会导致多种疾病的发生

［

1

］

o

外周神经中执行

*

［

基金项目

］

国家自然科学基金青年基金资助项目

(81701222)

转录因子

10(SRY-box

transcription

factor

10,

Sox10)

，

八聚体结合转录因子

6(octamer-binding

transcription

**

［

作者简介

］

关晋东

，

男

，

汉族

，

生于

1995

年

10

月

，

山西省晋城市人

，

硕士在读

，

研究方向:外周神经发育及损伤修复机制的研究

。

***

［

通信作者

］

孙诚，

电话

**************,

E-mail:

********************.cn

关晋东

，

等

.

G

蛋白耦联胆汁酸受体激动剂

INT777

通过激活

AMPK

信号通路抑制施万细胞成髓鞘过程

7

・

factor-6,

Oct6),

髓鞘早期生长因子

20

(early

growth

response-2,

Krox20

)

，

髓磷脂蛋白

(myelin

protein

zero,

MPZ

)

等

。

G

蛋白耦联胆汁酸受体

(

G-protein-coupled

bile

acid

receptor

1,

GPBAR1

,

同时也被称为

TGR5)

,

在

多种组织和器官中有不同水平的表达

，

功能多样耳

有报道网指出

TGR5

可通过激活环磷酸腺苷

(cyclic

adenosine

monophsphate,

cAMP)

-

单磷酸腺苷活化蛋

白

激酶

(adenosine

5

'

-monophosphate

-activated

pro

­

tein

kinase,

AMPK

)

信号通路调节恶性肿瘤的发生发

展过程

。

6a-

乙基

-23(S)-

甲基胆酸

［6

alpha-ethyl-23

(S)-methylcholic

acid,

INT777］

是

TGR5

特异性激动

剂

,

具有毒性低

、

效价高等特点

。

研究冋发现施万细胞

与背根神经节

(dorsal

root

ganglia,

DRG)

神经兀共培

养模型中

，

二丁酰环腺苷酸

(dibutyryl

cyclic

adenoslne

phosphate,

dbcAMP)

的添加能促进细胞分化

,

加速髓

鞘化进程

。

本研究旨在通过激动剂

INT777

处理原代

施万细胞

，

明确其对外周神经髓鞘化进程的作用

,

并初步探讨其作用机制

。

1

材料与方法

1.1

实验动物

出生

1d

的

SD

大鼠红皮

30

只购

于南通大学实验动物中心

。

1.2

实验试剂

Forsklin,

HRG(human

Heregulin-1)

、

dbcAMP

、

Trizol

、

ComC

(Compound

C)

均购于

MERCK

公司

，

DMEM

高糖培养基

、

胰蛋白酶

、

胎牛血清均购

于

Gibco

公司

，

SuperScript

IV/RT-PCR

Kit

Applied

Biosystem

SYBR

Green

Mix

购于

Thermo

Fisher

公

司

,

SDS-PAGE

凝胶购于碧云天生物公司

,

细胞裂解

液

RIPA,5xSDS-PAGE

电泳缓冲液

、

5xSDS-PAGE

Loading

buffer

、

10xTrans

buffer10x

三羟甲基氨基甲

烷盐酸盐溶液

(Tris

buffered

saline

tween,

TBST)

均在

实验室自配

。

1.3

实验方法

1.3.1

施万细胞培养施万细胞的分离纯化参考前

人方法，

进行稍许改良冋

。

出生

1d

的

SD

红皮鼠

,

5%

乙醇消毒,置于冰盒上冷冻麻醉

。

沿着坐骨神经走向

迅速分离

,

使神经充分暴露

,

尽快取出坐骨神经剪碎

并放置于预冷的

DMEM

培养基中

,

1

000

g

离心

5

min

,

弃上清

。

随后加入

1

mL

浓度为

3

mg/mL

的胶

原酶溶液

37

益

孵育

30

min,

1

000

g

离心

5

min

,

弃

上清

。

加入胰蛋白酶溶液

37

益

孵育

10

min

,

弃上清

，

加入完全培养基重悬

，

过

400

目筛网

，

并在中皿培养

。

过夜后，

换含

10

滋

mol/L

阿糖胞

^

(Cytarabine,

Ara-C)

培养

48

h

o

随后换含

2

滋

mol/L

Forskolin

和

50

ng/mL

HRG

的培养基

，

继续培养细胞

。

当密度达到接触抑

制时

，

吸出上清液

，

用

1

mL

含

Thy1.1

抗体的培养基

重悬细胞

，

冰上孵育

1h,1

000

g

离心

5

min

,

弃上

清

。

再用

1

mL

含补体的培养基

37

益

孵育

1

h,

离心

，

DMEM

高糖培养基重悬种于中皿等待后续实验

。

本

实验严格遵守南通大学动物实验伦理委员会要求

,

保障实验动物福利

。

1.3.2

施万细胞处理

5

滋

mol/L

的

INT777

处理施

万细胞

，

分为

4

组:对照组

(NC)

、

dbcAMP

处理组

(

终

浓度为

1

mmol/L)

、

INT777

处理组及

dbcAMP

+

INT777

处理组

。

随后,为了进一步验证可能的作用

机制

，

将施万细胞分为

4

组:对照组

(NC)

、

dbcAMP

处理

组

(

终浓度为

1

mmol/L)

、

dbcAMP+INT777

处理组及

dbcAMP+INT777

+ComC

(

终浓度为

10

nmol/L)

处理

组

。

药物处理

24

h

后收样用于后续研究

。

1.3.3

施万细胞总

RNA

提取实验过程严格按照

说明书步骤进行

。

通过

Trizol

试剂裂解施万细胞

，

经

氯仿变性及异丙醇沉淀后

,

最终获得高质量的总

RNAo

测定浓度,定量至

1

滋

g

后逆转录成

cDNA

第

1

链

,4

益

保存用于后续定量实时聚合酶链式反应试

验

(quantitative

real

time

polymerase

chain

reaction,

qPCR)

研究

。

1.3.4

施万细胞总蛋白质提取所有的步骤均在冰

上进行

。

药物处理后的施万细胞中加入预冷的细胞

裂解液

RIPA

250

滋

L,

用一次性细胞刮将细胞刮离

，

收集于

1.5

mL

的离心管中

。

冰上敷育

30

min

,

期间

不断震荡

，

4

益

，

12

000

r/min

离心

20

min

后

，

通过

BCA

方法进行蛋白质定量

。

各组样品蛋白浓度调至

相同水平

，

加入上样缓冲液

，

混匀后于

100

益

加热

5

min

,

冷却至室温用于后续

Western

Blot

分析

。

1.3.5

细胞免疫荧光细胞种于

24

孔板中预先放

置的玻片上

，

处理完毕后弃上清

，

多聚甲醛固定

。

磷

酸缓冲盐溶液

(phosphate

buffer

saline,

PBS)

洗

3

遍后

室温封闭

0.5

h

,

—

抗过夜

。

第

2

天

PBS

洗净一抗

，

二

抗室温孵育

2

h

,

PBS

洗

3

遍后染核

。

最后在载玻片

上滴加荧光封片剂

,

将玻片正面盖在载玻片上

，

蔡司

荧光显微镜拍照分析

。

1.3.6

qPCR

按照

Thermo

Fisher

公司说明书要求

进行实验

，

每个样品做

3

个生物学重复

，

对结果中的

Cq

值

，

按照

2

盘

。

方法进行计算分析

。

引物序列为

：

18S

rRNA

正向引物:

5

'

-AGCTCCAATAGCGTATAT-

TAAAG-3'

;

负向弓丨物

：

5

'

-CGGTCCTATTCCATTAT-

TCCTA

-3'

。

Krox20

正向引物

：

5

'

-TGGGTTTAAG

-

8

・

南通大学学报

（

医学版

）

2021

:

41(1)

TATGGCTGTATA-3

'

;

负向弓

【

物

：

5

'

-AGTTAGTGGT-

TCTGTGTTAGA

-3'

。

MPZ

正向引物

：

5

'

-GGATAA

GAAATAGCGGTTAGC

-3'

;

负向弓丨物

：

5

'

-TTGAGG-

CTGGTTCTACTG

-3'

。

Oct6

正

向引物

：

5

'

-TTCC

-

TAATTTCTGACCCATCT-3

'

;

负

向引物

：

5

'

-GCAAT-

AAAGATACAAAGAGAATGG-3

'

。

1.3.7

Western

Blot

预先制备十二烷基硫酸钠聚

丙烯酰胺凝胶

，加样后进行电泳和转膜

。

室温封闭

1

h

,

一抗

4

益

过夜

。

隔天用含有吐温的

TBST

洗净一抗,

注:

A,

DAPI

标记施万细胞核;

B,

TGR5

定位于施万细胞的膜

和胞质中

；

C,

MERGE,

DAPI

与

TGR5

的合图

。

图

1

TRG5

在原代施万细胞中的表达定位

■

NC

Q

dbcAMP

=

INT777

MINT777+dbcAMP

**

***

室温孵育二抗

1

h,TBST

洗净

，

最后配置显影液显影

。

61

4"

*

***

***

1.3.8

统计学方法采用

SPSS

25.0

统计学软件进

行数据分析

,

以

軃

s

表示

，

两组间比较采用

t

检验

，

组

间比较采用

one-way

ANOVA

检验,

P

<0.05

为差异

1_

'1

2-

有统计学意义

。

2

结

果

0

Krox20

Od6

MPZ

注

：

*

P<0.05

,

**

P<0.01

,

***

P<0.001

。

2.1

TGR5

在施万细胞的定位

通过细胞免疫荧光

技术观察

TGR5

在施万细胞中的表达情况

，

结果显示

图

2

INT777

抑制

dbcAMP

诱导施万细胞成髓鞘模型中髓鞘

相关基因的表达

TGR5

表达于施万细胞的膜与细胞质中

（

图

1

）

。

因此,

施万细胞体外添加激动剂

INT777

可有效激活

TGR5

。

过

Western

印迹技术探究

INT777

抑制髓鞘基因表

达的可能机制

，

其中

dbcAMP

可有效诱导体外施万

2.2

INT777

抑制髓鞘相关因子的表达

qPCR

技术

检测

INT777

与

dbcAMP

诱导分化施万细胞成髓鞘

之间的关系

。

结果显示

,5

滋

mol/L

的

INT777

处理可

显著抑制髓鞘相关基因如

6

及

MPZ

的

表达

（

图

2

）

。

细胞髓鞘的分化形成

，

因而通常用作阳性对照组

。

实

验结果显示

INT777

促进了

p-AMPK

的表达

，

抑制

p-ERK

与

p-S6K

的活性

（

图

3

）

,

因此

，

推测

INT777

可能是通过激活

AMPK

进而抑制

S6K

活性来抑制

施万细胞的成髓鞘过程

。

2.3

INT777

激活施万细胞

p-AMPK

信号通路

通

A

dbcAMP

-

INT777

-

+

-

B

-

+

+

+

p-S6K/0-acti

n

z

5

5

■

z

'

L

5

0

L

'

5

5

0

0

p-AMPK/AMPK

p-ERK/ERK

MPZ/0-actin

p-S6K

［

「

-----

—

p-AMPK

|

一

一

•

-

—

INT777

-

-

+

+

dbcAMP

-

+

-

+

注:

A,Western

Blot

结果

;B,A

图的统计结果

。

*

P<0.05

,

**

P<0.01

,

***

P<0.001

o

图3

INT777影响

dbcAMP

诱导施万细胞成髓鞘模型中

AMPK/S6K

信号通路

2.4

ComC

促进施万细胞髓鞘的形成

ComC

是

AMPK

特异性的抑制剂,之前的实验结果显示

INT777

通过激活施万细胞

AMPK

活性抑制了髓鞘相关基

3

讨

论

PNS

中的外周神经纤维是传输神经冲动的主要

载体,而外周神经纤维主要由轴突

、

髓鞘和结缔组织

因的表达

,

为进一步证实这个猜想

,

随后在细胞内加

入

10

nmol/L

ComC

来抑制

AMPK

活性

，

qPCR

及

构成的神经内膜组成

，

其中影响神经冲动传导的关

键是髓鞘叫髓鞘主要是由施万细胞以

1

：

1

模式包裹

Western

Blot

结果显示相对于

INT777

处理组而言

，

ComC

与

INT777

双处理后逆转了

INT777

对髓鞘基

因表达的抑制效果

（

图

4

）

。

直径

>

1

滋

m

的轴突而形成的阻施万细胞不仅在维持

外周神经稳态和髓鞘发育过程中发挥重要作用

，

且

关晋东

，

等

.

G

蛋白耦联胆汁酸受体激动剂

INT777

通过激活

AMPK

信号通路抑制施万细胞成髓鞘过程

9

・

A

・

NC

5

4

3

2

1

0

口

dbcAMP

B

ComC

dbcAMP

INT777

口

INT777+dbcAMP

酬

INT777+dbcAMP+ComC

**

_

*

-

-

-

-

+

-

-

+

+

+

+

+

^

首

戈

之

电

Krox20

Octo

MPZ

p-AMPK/AMPK

p-S

6K

/0-actin

2.5

-■

2.0

p-ERK/ERK

!

I

***

|

**

**

匕

U

***

MPZ/p-actin

**

*

**

***

1

1.0

0

”

|

<

■

--------

~

1

~

I

--------

1

■

r

-----

~~

""I

1.5

1.0

0.5

0.0

INT777

-

-

+

+

-++

0.0

++

+++

++

+

dbcAMP

-

+

+

+

+++

++

ComC

-

-

-

+

注:A,qPCR

结果;

B

,

Western

Blot

结果

;C,B

图的统计结果。

**

P<0.01

,

***

P<0.001

图

4

ComC

挽救

INT777

对施万细胞髓鞘相关基因表达的抑制作用

能修复损伤的髓鞘

[9]

o

外周神经髓鞘形成过程分为预髓鞘阶段和成熟

髓鞘阶段,是一个严谨的

、由多种转录因子参与调控

果显示在施万细胞中

5

滋

mol/L

INT777

的处理激活

了

AMPK

,

推测这一现象可能与

INT777

浓度有关

。

INT777

Deoxycholic

acid

、

TGR5

Receptor

Agonist

等

都是

TGR5

的激活剂，

其中

INT777

因其特异性佳,

的复杂生理过程

。

研究问表明

，

转录因子

Sox10

与

Oct6

主要存在于预髓鞘阶段

,Sox10

是施万细胞形

成髓鞘并维持其稳定所必需的

，

且能激活

Oct6

,

从

而启动施万细胞进入预髓鞘化阶段

。

Sox10

与

Oct6

协同作用可诱导转录因子

Krox20

的表达

，

从而促使

效果好

,

毒性小而常被研究者使用

。

研究凹指出

,

溶

血磷脂酸

LPA

通过刺激施万细胞等胶质细胞来调

节氯喹和

TGR5

激动剂

INT777

引起的神经元反

应

，

如瘙痒

、

疼痛等症状

。

有研究㈣报道指出脂肪细

胞及肝脏细胞经

INT777

处理显著地提高了胞内

预髓鞘阶段向髓鞘化阶段转变

。

Krox20

因子一方面

可激活大量髓鞘化基因如

MPZ

及髓磷脂碱性蛋白

cAMP

的表达

，

提高了细胞能量代谢效率

,

而

INT777

在

dbcAMP

诱导的原代施万细胞成髓鞘模型中是否

也发挥着同样的作用及具体的作用机制有待进一步

研究

。

(myelin

basic

protein,

MBP)

的表达

，

另一方面可抑制

去髓鞘化基因

(

Sox2

、

c-Jun

)

的表达

,

通过这两方面的

作用

，

促进稳定成熟的髓鞘套的形成问

。

虽然对外周

神经髓鞘形成过程的研究很多

，

但具体的作用机制

众所周知

,

AMPK

的活化可以延缓合成代谢反

应

,

降低能量消耗

,

已有报道

01

指出

AMPK

可以负向

调控外周神经髓鞘的发育。

施万细胞中

LKB1-AMPK

并不十分清楚

。

TGR5

属于

GPCR

家庭成员

，可以调节能量平衡

和糖代谢过程

，

促进胰岛素的分泌和生物合成

[12]

,

参与多种肿瘤的发生发展过程

[13]

,可激活炎症因子

而产生抗炎

、

利胆作用

[14]

,也可减轻肝脏炎症

，

抑制

和

mTOR

信号网络调节轴突完整性和髓鞘的形

成㈣

。

本研究中

,INT777

的处理抑制了髓鞘相关因

子

Krox20

、

Oct6

及

MPZ

的表达

，

且促进了

p-AMPK

动脉粥样硬化斑块形成问

。

TGR5

作为膜受体

，可与

相应配体结合内化到细胞质中

，

在核因子

-

k

B

、

蛋白

的表达

,

这与前人㈣报道一致

。

mTOR

信号通路是调

控外周神经髓鞘发育的经典的信号途径

,

而

p-S6K

是非常关键的调控因子㈣

。

髓鞘形成是一种代谢性

生理过程

,mT0R

信号通路作为一种协调细胞代谢

激酶

B(protein

kinase

B,

PKB)

和细胞外信号调节激

酶

(extracellular

regulated

protein

kinase,

ERK

)

等信号

通路中发挥重要作用皿叫该受体经典的下游靶标是

的信号中枢

，

被认为是髓鞘形成的关键信号㈤。

本研

究显示

INT777

的处理提高了

p-AMPK

的表达

，

抑

cAMP

(

由乙酰辅酶

A

催化

ATP

后形成

)

，

可直接提高

体内

PKA

活性

，

抑制

AMPK

活性两

。

但是

,本研究结

制了

p-S6K

的活性

，

表明该药物对外周神经髓鞘的

-

10

・

南通大学学报

（

医学版

）

2021

:

41(1)

影响可能是通过激活

AMPK

,

抑制

S6K

活性来发挥

作用的

。

为进一步验证这一猜想

,

在

INT777

处理的

施万细胞中又同时添加了

AMPK

的抑制剂

ComC

,

通过

Western

Blot

等证实

ComC

的添加逆转了

INT777

对髓鞘发育过程的抑制现象

。

表明

INT777

可能通过

AMPK

信号通路发挥其对髓鞘化过程的

影响

。

总之

,

INT777

可抑制

dbcAMP

诱导的施万细胞

髓鞘化过程

，

并且是通过激活

AMPK

活性

，

抑制

S6K

活性来实现的

。

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收稿日期

]

2020-07-13