激活TRPM8通道对正常和慢性低氧肺高压大鼠肺动脉上钙池操纵性钙内流(S

2024-07-28 作者:

激活TRPM8通道对正常和慢性低氧肺高压大鼠肺动脉上钙池操

纵性钙内流（SOCE）的调控

肺高压（pulmonary hypertension,PH）的显著特征是肺血管收缩增强和肺血管重塑,主要由肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle

cells,PASMCs）胞浆内游离Ca²⁺浓度(intracellular free calcium

concentration,[Ca²⁺]_i)的持续升高引起。研究表明,钙池操纵性钙通道(store-operated Ca²⁺channel,SOCC)所介导的钙池操纵性钙内流（store-operated calcium entry,SOCE）在特发性肺动脉高压（idiopathic pulmonary arterial hypertension,IPAH）患者及PH动物模型的PASMCs中均显著增强,并且在PH发展过程中发挥重要作用。

研究表明,PH大鼠模型PASMCs中melastatin相关的瞬时受体电位8（melastatin-related transient receptor potential 8,TRPM8）的表达显著下调,并且激活TRPM8通道后能够引起预收缩肺动脉（pulmonary arteries,PAs）的舒张。然而,TRPM8通道诱导肺血管舒张的机制尚不明确。

本研究在常氧和慢性低氧性肺高压（chronic hypoxia-induced pulmonary

hypertension,CHPH）大鼠模型基础上,首先检测CHPH大鼠PASMCs中TRPM8和TRPC1表达和通道功能活性的变化,以及TRPC1介导的SOCE功能的变化,进而观察TRPM8通道激活对SOCC特异性激动剂环匹阿尼酸（cyclopiazonic acid,CPA）和内皮素-1（Endothelin-1,ET-1）诱导的大鼠PAs收缩效应的影响,对CPA诱导的大鼠PASMCs[Ca²⁺]_i升高和SOCE增强的影响,以及对CPA诱导的大鼠和人PASMCs胞膜钙池操纵性阳离子电流(store-operated

cation current,I_SOC)的影响。以期研究PH发展过程中TRPM8和

SOCE功能之间的关系,从而为PH发病机制的阐明及其靶向治疗提供新的科研依据。

第一部分激活TRPM8通道对SOCE介导的正常和慢性低氧肺高压大鼠肺动脉张力的作用目的:检测CHPH大鼠中TRPM8表达和SOCE功能的变化,观察TRPM8通道激活对CPA和ET-1诱导的大鼠PAs收缩效应的影响。方法:清洁级雄性SD大鼠常压慢性低氧（chronic hypoxia,CH）处理3周构建CHPH大鼠模型,在此基础上采用:（1）血流动力学检测方法,利用米勒压力导管（Mikro-Tip pressure

catheter）测定大鼠右心室收缩压（right ventricular systolic pressure,RVSP）和肺动脉平均压(mean pulmonary arterial pressure,mP_Pa),分离右心室（right ventricular,RV）,计算右心室重量指数（right ventricular mass

index,RVMI）的变化;（2）实时荧光定量PCR和Western blot检测方法,测定大鼠去内皮PAs中TRPM8和SOCC主要构成者经典瞬时感受器电位通道1（canonical

transient receptor potential,TRPC1）mRNA和蛋白的表达水平;（3）共聚焦免疫荧光法,测定PASMCs中TRPM8和TRPC1通道蛋白的定位情况,计算荧光强度比较两者在CHPH大鼠中的变化;（4）血管环张力检测方法,观察TRPM8通道特异性激动剂icilin对SOCC特异性激动剂CPA和ET-1诱导的大鼠PAs收缩效应的影响,及在CHPH大鼠中的变化。

结果:与正常对照组（control,CON）大鼠相比,（1）CHPH模型大鼠的RVSP、mP_Pa以及RVMI均显著增高,提示PH大鼠模型构建成功;（2）CHPH大鼠去内皮PAs中TRPM8表达显著降低,而TRPC1表达明显增高,提示在PH的发展过程中TRPM8和TRPC1的表达及其通道功能的变化可能呈相反趋势;（3）PASMCs中TRPM8和TRPC1通道蛋白都广泛表达,且CHPH大鼠PASMCs中TRPM8蛋白荧光

强度显著降低,而TRPC1蛋白荧光强度显著增高,与上述蛋白和基因表达结果一致;（4）CHPH大鼠中CPA诱导的去内皮PAs收缩效应显著增高,icilin剂量依赖性抑制CPA诱导的PAs收缩效应,且抑制剂的抑制率在CHPH大鼠显著增加,而TRPM8通道特异性阻滞剂AMTB能够逆转抑制剂的作用,提示CHPH大鼠PAs中SOCE功能显著增强,激活TRPM8通道能够抑制SOCE;（5）单剂量icilin（10μM）抑制CPA诱导的PAs收缩效应,且抑制率在CHPH大鼠显著增加,在此基础上继续加入SOCC特异性抑制剂钆离子(gadolinium,Gd³⁺)能够引起血管的进一步舒张,相反,在Gd³⁺抑制CPA诱导的PAs收缩效应基础上继续加入icilin并没有引起血管的显著舒张,提示TRPM8激活能够抑制SOCE,且icilin舒张血管的作用可能包含在Gd³⁺的作用范围内;（6）CHPH大鼠中ET-1诱导的PAs收缩效应显著增高,且icilin和Gd³⁺对ET-1诱导的PAs收缩效应舒张作用也明显增大,同样,在icilin舒张血管的基础上继续加入Gd³⁺引起进一步的血管舒张,而Gd³⁺作用基础上继续加入icilin并没有引起血管的进一步舒张,提示CHPH模型大鼠PAs上ET-1的高反应性和SOCE功能的增强,进一步表明激活TRPM8通道能够抑制ET-1诱导的SOCE,且icilin舒张血管的作用可能包含在Gd³⁺的作用范围内。结论:CH预处理3周能够成功诱导大鼠发生PH和右心肥厚;其机制可能是CHPH大鼠PASMCs中TRPM8的表达降低,而TRPC1的表达显著上调,引起TRPC1所介导的SOCE功能显著增强,且TRPM8的下调使其对SOCE功能的抑制作用减小,进一步引起PASMCs[Ca²⁺]_i增高,PAs血管收缩增强和血管重塑,促进PH的发生发展。

第二部分激活TRPM8通道对正常和慢性低氧肺高压大鼠肺动脉平滑肌细胞

SOCE的作用目的:观察TRPM8通道激活对CHPH模型大鼠

PASMCs[Ca²⁺]_i的增加及SOCE功能增强的影响,以进一步明确TRPM8通道激活对SOCE功能的调控,及其在PH发病过程中的作用。方法:在CHPH大鼠模型的基础上,采用:（1）Mn²⁺淬灭Fura-2荧光检测方法,测定icilin和CPA分别诱导大鼠PASMCs胞膜Ca²⁺内流速率的变化,以及TRPM8通道激活对CPA诱导的大鼠PASMCs胞膜Ca²⁺内流速率的影响;（2）Fluo-3荧光检测PASMCs[Ca²⁺]_i方法,测定TRPM8通道激活对CPA诱导的大鼠PASMCs胞膜静息

[Ca²⁺]_i和Ca²⁺内流的影响;（3）Fluo-3荧光检测PASMCs[Ca²⁺]_i方法,不影响静息

[Ca²⁺]_i和Ca²⁺释放条件下,测定TRPM8通道激活对CPA诱导的大鼠PASMCs胞膜Ca²⁺内流的影响。

结果:与正常大鼠相比,（1）CHPH模型大鼠中,icilin诱导的PASMCs胞膜Mn²⁺淬灭最大速率显著降低,且加入Mn²⁺500s后荧光信号降低的百分比也显著降低,相反,CPA诱导的Mn²⁺淬灭最大速率显著增大,加入Mn²⁺500s后荧光信号降低的百分比也显著增加,提示TRPM8通道功能活性在CHPH大鼠中显著降低,而SOCE功能增强;（2）TRPM8通道激活能够显著抑制CPA诱导的Mn²⁺淬灭最大速率,以及加入Mn²⁺500s后荧光信号降低的百分比,且抑制率在CHPH大鼠中更大,提示PASMCs中TRPM8通道激活能够显著抑制SOCE的功能;（3）TRPM8通道激活能够显著抑制CPA诱导的PASMCs胞膜[Ca²⁺]_i升高作用,且抑制率在CHPH大鼠中更显著,而TRPM8通道特异性阻滞剂AMTB能够逆转抑制

剂的抑制作用,更直接的表明激活TRPM8通道能够抑制SOCE功能;（4）TRPM8通道激活能够显著抑制CPA诱导的PASMCs胞膜静息

[Ca²⁺]_i水平,且抑制率在CHPH大鼠中更显著,而icilin对Ca²⁺释放无显著抑制作用,进一步提示PASMCs中TRPM8通道激活抑制SOCE功能;（5）PASMCs静息[Ca²⁺]_i正常水平下,icilin干预后同样显著抑制CPA诱导的Ca²⁺内流。结论:CHPH大鼠PASMCs中TRPM8通道功能显著降低,SOCE功能显著增强。

TRPM8通道激活后显著抑制PH大鼠PASMCs中

[Ca²⁺]_i的增加及SOCE功能的增强。第三部分激活TRPM8通道对正常大鼠和人肺动脉平滑肌细胞钙池操纵性阳离子电流的作用目的:观察TRPM8通道激活对正常大鼠和人PASMCs胞膜SOCC介导的

I_SOC的影响,进一步明确TRPM8通道激活对SOCE功能的调控。

方法:在正常大鼠和人PASMCs上,采用:（1）全细胞膜片钳技术,测定icilin和Gd³⁺分别对CPA诱导的正常大鼠PASMCs胞膜I_SOC的影响;（2）全细胞膜片钳技术,测定icilin和Gd³⁺分别对CPA诱导的人PASMCs（HPASMCs）胞膜I_SOC的影响。结果:（1）正常大鼠中,成功记录到CPA诱导的PASMCs胞膜I_SOC,SOCC特异性抑制剂Gd³⁺显著抑制I_SOC,而且TRPM8通道特异性激动剂icilin呈剂量依赖性抑制I_SOC,提示PASMCs中TRPM8通道激活能够显著抑制I_SOC;（2）正常大鼠中,单剂量icilin显著抑制PASMCs胞膜I_SOC,在此基础上继续加入Gd³⁺后能够引起I_SOC的进一步降低,再次提示TRPM8通道激活能够抑制

I_SOC,且icilin抑制I_SOC的作用可能包含在

Gd³⁺的作用范围内;（3）HPASMCs中,icilin和Gd³⁺均能够显著抑制CPA诱导的I_SOC,同样,在icilin作用的基础上,Gd³⁺能够引起I_SOC的进一步降低,提示在HPASMCs中激活TRPM8通道同样可以抑制I_SOC,再次表明icilin抑制I_SOC的作用可能包含在Gd³⁺的抑制作用范围内。

结论:在大鼠和人的PASMCs中,激活TRPM8通道均能够显著抑制CPA诱导的I_SOC,更直观的表明TRPM8通道激活与SOCE功能的调控关系密切。表明icilin可能通过激活TRPM8抑制大鼠PASMCs和HPASMCs胞膜

I_SOC,抑制SOCE的功能,从而舒张激动剂诱导的大鼠PAs的收缩效应,抑制PASMCs胞膜Ca²⁺内流速率和[Ca²⁺]_i。

综上所述,PASMCs中TRPM8表达和功能活性的降低以及SOCE功能的上调在CHPH致病过程中发挥了重要作用。CH通过上调SOCC主要构成者TRPC1的表达,引起TRPC1所介导的SOCE功能显著增强,且TRPM8的下调使其对SOCE功能的抑制作用减小,进而引起PASMCs[Ca²⁺]_i增高,PAs血管收缩增强和血管重塑,促进PH的发生发展。

TRPM8通道的激活通过抑制PASMCs中[Ca²⁺]_i的增加及SOCE功能的增强,发挥其抑制大鼠PAs血管收缩效应的作用。此外,在大鼠和人PASMCs中,TRPM8通道的激活显著抑制I_SOC,进一步表明TRPM8通道与SOCE功能的调控密切相关。

胞膜TRPM8激活后影响到SOCC的开放,甚至使通道关闭,Ca²⁺不能通过,从而降低PASMCs胞膜I_SOC,抑制SOCE的功能。以上结果

为PH发病机制的阐明和及其靶向治疗提供新的科研依据。