染色体8p21区域胃癌相关EST的筛选

2024-07-28 作者:

第３８卷第２期　Ｖｏ１．３８　Ｎｏ．２　・南华大学学报・医学版　Ｊｏｕｒｎａ１　ｏｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈ　Ｃｈｉｎａ　ｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　２０１０年３月　Ｍａｒ．２０１０　肿瘤学研究・　染色体８ｐ２１区域胃癌相关ＥＳＴ的筛选　董娟慧　。唐雪芳　，王妍　。罗桥　，贺修胜　（１．南华大学肿瘤研究所，湖南衡阳４２１００１；２．湘乡市人民医院）　摘要：　目的　筛选胃癌发病相关的表达序列标签，为克隆胃癌相关新基因奠定工作基础。　方法在染　色体８ｐ２１—２２区域定位查找ＥＳＴｓ，经ＢＬＡＳＴ比对分析，筛选出符合条件的ｌＯ个ＥＳＴ，选取其中４个进行引物设　计；收集２８例胃癌手术切除的新鲜标本，切取胃癌组织为实验组，远离癌组织（／＞５　ｃｍ）的胃黏膜组织作为正常对　照组，分别提取胃癌及正常胃黏膜组织总ＲＮＡ，运用ＲＴ—ＰＣＲ方法检测ＥＳＴ的表达水平，筛选出在胃癌和正常胃　黏膜中表达差异的ＥＳＴ。　结果ＲＴ—ＰＣＲ结果显示：ＥＳＴ　ＤＡ９３１８６９在正常胃黏膜组织中阳性表达率为８９．２８％　（２５／２８），在胃癌组织中阳性表达率为４６．４３％（１３／２８），两者比较差异有显著性（Ｐ＜０．０５）；其中高分化胃癌中阳　性表达率８３．３３％（５／６），明显高于中分化胃癌５７．１４％（４／７）和低分化胃癌２６．６７％（４／１５），差异均有显著性（Ｐ＜　Ｏ．Ｏ５）；无淋巴结转移胃癌阳性表达率６０．００％（９／１５）高于有淋巴结转移胃癌的阳性表达率３０．７７％（４／１３），差异　有显著性（Ｐ＜０．０５）。　结论达下调或缺失。　ＥＳＴ　ＤＡ９３１８６９在胃癌组织中的阳性表达率低于正常胃黏膜组织，胃癌中该ＥＳＴ表　关键词：　胃癌；表达序列标签（ＥｓＴ）；８ｐ２１；逆转录ＰｃＲ（ＲＴ—ＰＣＲ）　中图分类号：Ｒ７３５．２　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７２—７４４４（２０１０）０２—０２０６—０４　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ＥＳＴｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｗｉｔｈ　Ｇａｓｔｒｉｃ　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｏｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　８ｐ２　１　ＤＯＮＧ　Ｊｕａｎ—ｈｕｉ，ＴＡＮＧ　Ｘｕｅ—ｆａｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｙａｎ。ｅｔ　ａｌ　（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＳｏｕｔｈ　Ｃｈｉｎａ，Ｈｅｎｇｙａｎｇ，Ｈｕｎａｎ　４２１００１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎ　ｔｈｅ　ＥＳＴｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ　ｎｏｖｅｌ　ｇｅｎｅｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｚ　ＥＳＴ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏ－　ｍｏｓｏｍｅ　８ｐ２１　ｒｅｇｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＢＬＡＳＴ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ａｎｄ　１０　ＥＳＴｓ　ｗｅｒｅ　ｆｉｌｔｅｒｅｄ　ｏｕｔ．Ｗｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　４　ＥＳＴｓ　ｔｏ　ｄｅｓｉｇｎ　ｐｒｉｍｅｒｓ．２８　ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｓｕｒ　ｒｙ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ａｓ　ｃａｎｃｅｒ　ｇｒｏｕｐｓ，ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｎｏｒｍａｌ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｍｕｅｏｓａ　ａｗａｙ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃａｎｃｅｒ　ｐｏｉｎｔ　ａｓ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ．Ａｌｌ　ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ｄｉａｇｎｏｓｅｄ．　Ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｏｕｔ。ｗｉｔｈ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｌｐｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ—ＰＣＲ），ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎ　ｔｈｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ＥＳＴ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＥＳＴ　ＤＡ９３１８６９　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆ－　ｆｅｒｅｎｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｍｕｃｏｓａ　ｂｙ　ＲＴ—ＰＣＲ　ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＥＳＴ　ＤＡ９３１８６９　ｗａｓ　８９．２８％ｆ２５／２８）ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｍｕｃｏｓａ，ａｎｄ　４６．４３％（１３／２８）ｉｎ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ。ｗｈｉｃｈ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｏｒ　ａｂｓｅｎｔｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｍｕｃｏｓａ．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＥＳＴ　ＤＡ９３　１　８６９　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｗｅｌｌ—ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｗａｓ　８３．３３％（５／６），ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｉｎ　ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｃａｒ－　ｃｉｎｏｍａ　５７．１４％（４／７）ａｎｄ　ｉｎ　ｐｏｏｒ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　２６．６７％（４／１５）（Ｐ＜０．０５）．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ－ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＥＳＴ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｌｙｍｐｈｏｉｄ　ｎｏｄｅ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ—ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｗａｓ　６０．００％（９／１５）．ｓｉｎｉｇｉｆｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈ・　ｅｒ　ｔｈａｎ　ｉｎ　ｌｙｍｐｈｏｉｄ　ｎｏｄｅ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ—ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｃｒｃｉａｎｏｍａ　３０．７７％（４／１３）（Ｐ＜０．０５）．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＤＡ９３１８６９　ｉｓ　ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｉｎ　ＧＣ。ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ　ｉｔ　ｍａｙ　ｐｌａｙ　ａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ＧＣ　ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｇａｓｔｉｒｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＧＣ）；　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ（ＥＳＴ）；８ｐ２１；　ＲＴ—ＰＣＲ　收稿日期：２００１０一Ｏ１—２５　通讯作者：贺修胜，博士，教授，Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｅｘｉｕｓｈｅｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ．　胃癌（ＧＣ）是世界范围内最常见的消化道恶性　者术前均未经化疗和放疗。２８例标本中，男性ｌ８　肿瘤之一，高发于日本、中国和中南部美洲的大部分　地区。胃癌的发生与幽门螺杆菌感染、饮食、癌前病　例，女性１０例，最大年龄７８岁，最小年龄３１岁，平　均年龄５５岁，其中高分化胃癌６例，中分化胃癌７　例，低分化胃癌ｌ５例；有淋巴结转移１３例，无淋巴　结转移ｌ５例。手术标本离体后１０　ｍｉｎ内切取胃癌　及正常胃黏膜组织（距离胃癌边缘＞５　ａｍ胃黏膜组　织作为正常对照），分别切取胃癌及正常胃黏膜组　织重约１００　ｍｇ，迅速置于ＤＥＰＣ处理和灭菌的１．５　变及遗传等多种因素有关。现代肿瘤分子遗传学研　究表明，遗传因素尤其癌基因和／或抑癌基因的改变　是导致肿瘤发生发展的重要原因之一。研究证实，ｅ　—ｍｅｔ、ｒａｓ等¨　癌基因的表达增高，和ｐ５３、ＡＰＣ、　ＤＣＣ等　．４　抑癌基因的表达下调，均存在于ＧＣ的病　理发生发展过程中。随着人类基因组计划的完成、　ｍＬ　ＥＰ管内，放人液氮中速冻保存备用。所有标本　大规模测序草图的公布，基因克隆工作显得尤为重　要，特别是对致病基因的克隆。研究显示，ＧＣ中存　在８号染色体高频率杂合性丢失（ＬＯＨ），尤其在　８ｐ２１—２２常见缺失区域位点ＬＰＬ和Ｄ８ｓ２５８之间，　ＬＯＨ频率分别高达３９％和３３％Ｌ　ｓｊ，提示Ｄ８Ｓ２５８位　点附近可能存在与ＧＣ发生密切相关的抑癌基因。　本文充分利用现有数据库中的大量表达序列标　签（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ，ＥＳＴ）资源，从ＧＣ高频率　ＬＯＨ位点８ｐ２１—２２区域的ＥＳＴｓ着手，运用ＲＴ—　ＰＣＲ方法，筛选胃癌相关的差异表达ＥＳＴ，为寻找与　克隆胃癌发生过程中的相关新基因奠定基础。　１　材料与方法　１．１　ＥＳＴ的筛选　从染色体ＬＯＨ位点８ｐ２１区域的ＥＳＴ标记图谱　着手，进人美国国家生物技术信息中心（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）ＥＳＴ数据　库，首先在ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳＴ／　ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ输入８号染色体信息，找到几百条ＥＳＴｓ，　然后在ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ／　ｍａｐ．ｃｇｉ直接点击８号染色体相应区带，查找到几　百条ＥＳＴｓ。对查找到所有ＥＳＴｓ在ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．１ｌＣ—　ｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ下进行同源性比较、分析，剔　除代表已克隆基因的ＥＳＴｓ。然后将剩余的ＥＳＴｓ，在　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ下进行ＥＳＴｓ　之问的同源性比较、分析，剔除来源于同一族的　ＥＳＴ。选择的标准是：与已知基因同源性＜５０％，代　表未克隆基因；序列长度＞４００　ｂｐ；来源于染色体　８ｐ２１区域；序列中不含Ａｌｕ重复序列；有关于染色　体定位信息的说明。　１．２标本来源及处理　新鲜标本取材于南华大学附一医院２００６年７　月～２００８年１０月胃癌手术切除标本，所有胃癌患　另取部分组织于中性福尔马林液固定，常规切片，　ＨＥ染色，用作病理诊断。　１．３组织总ＲＮＡ提取　加入液氮预冷碾钵，将组织从液氮中取出，迅速　放人盛有少量液氮的碾钵内碾碎，再加入１　ｍＬ　ＴＲ—　Ｉｚｏｌ试剂（购自ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ公司）碾磨，液氮尚未挥　发尽前，ＴＲＩｚｏｌ及碾碎组织一同移人１．５　ｍＬ　ＤＥＰＣ　处理ＥＰ管中，其余步骤按说明书操作。　测定ＲＮＡ浓度和纯度：取１　ｔｘＬ　ＲＮＡ溶液稀释　１００倍，用紫外分光光度仪测定　６Ｏ和　８Ｏ的吸　光值（ＯＤ值），鉴定ＲＮＡ质量，实验标本ＯＤ２６０／　０Ｄ２８０比值均介于１．７０—１．９５之间。　１．４逆转录ＰＣＲ　胃癌组织及正常胃黏膜组织提取的总ＲＮＡ，经　ＤＮａｓｅ　Ｉ（ＴＡＫＡＲＡ公司）消化痕量ＤＮＡ，苯酚、氯　仿抽提，将纯化的总ＲＮＡ按逆转录试剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ　公司）说明书进行逆转录。根据引物设计原则，从　ＧｅｎｅＢａｎｋ中查询Ｂ—ａｃｔｉｎ的完整ｅＤＮＡ序列及筛　选出的４个ＥＳＴ，用软件Ｐｒｉｍｅｒ　５．０辅助设计ＰＣＲ　引物。通过ＢＬＡＳＴ软件比较为特异性引物，送上海　生工合成，ＰＡＧＥ纯化（见表１）。　取逆转录产物２　ＩｘＬ作模板进行ＰＣＲ反应，每　管ＰＣＲ体系中同时加入内对照（ｐ—ａｃｔｉｎ）引物和目　的引物，总反应体系５Ｏ　。反应条件：９４℃预变性　５　ｒａｉｎ，然后９４℃１　ｍｉｎ，５０℃４５　Ｓ，７２℃３０　Ｓ，共３Ｏ　个循环，最后７２℃延伸５　ｍｉｎ。取５　ＰＣＲ产物点　样于１．０％琼脂糖凝胶（含溴化乙锭０．５　ｍｒ，／ｍＥ），　５Ｏ～８Ｏ　Ｖ，电泳２０—４０　ｍｉｎ，凝胶成像系统观察结　果。凝胶用薄层扫描仪进行灰度扫描，分析各产物　的灰度值（Ｖ值），将目的基因的Ｖ值（Ｖｘ）分别与　对应标本的ＶＢ…曲相比（Ｒｘ＝Ｖｘ／Ｖ１３…　）。相对　表达强度Ｒ）【代表样本目的基因相对表达量。并用　统计学软件ＳＰＳＳ１３．０进行）（　检验，Ｐ＜０．０５为差　异有统计学意义。　２０７　表１　ＥＳＴｓ筛选所用引物　引物名　Ａ１１２５３４０一Ｌ　ＡＩ１２５３４Ｏ—Ｒ　ＣＲ７４５５３１一Ｌ　ＣＲ７４５５３　１一Ｒ　筛选１Ｏ条符合条件的ＥＳＴｓ，选取其中序列相对较　引物位置　ＥＳＴＡＩ１２５３４０　引物序列（５　一３　）　ＧＴＧＧＣＣＡＡＴｒＧＴＣＴＧＴＧＴＡＣＣ　ＩＴｒＧＣＴＴＧＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡ　ＴＣＴＡＣＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴ　ＡＣＣＣ　Ｉ－ＧＴＡＴＡＡＣＴＴＧＧＣＡＴＴ　长的４条ＥＳＴ，进行实验分析（图１）。　２．２　胃癌手术标本ＨＥ染色病理学确诊　２８例胃癌手术标本均制作ＨＥ切片病理确诊，　ＥＳＴＣＲ７４５５３１　其中低分化胃癌ｌ５例，中分化胃癌７例，高分化胃　癌６例（图２）。　ＤＡ９３１８６９一Ｌ　ＤＡ９３ｌ８６９一Ｒ　ＢＣ７５２９１６一Ｌ　ＣＣＣＣＣＴＧＡＧＴＡＴＴＣＴＧＣＴＧ　ＧＴＩ　ＧＴＴＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣ　ＣＴＧＴＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧ　ＥＳＴＤＡ９３１８６９　ＥｓＴＢＧ７５２９１６　ＢＧ７５２９１６一Ｒ　ＣＧＧＧＴＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＡＴＣＡＣＴＣ　Ｂ—ａｃｔｉｎ—Ｌ　Ｂ—ａｃｔｉｎ—Ｒ　ＧＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＡＣＣＴＣ　ＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴ１℃ＣＴＧＡＴ　∽　Ｈ　～¨　∞　Ｈ　２　结　果　图１定位查找位于染色体８ｐ２ｌ区域的ＥＳＴｓ　２．１　ＥＳＴｓ网上定位查找与筛选　染色体ＬＯＨ位点８ｐ２１区域的ＥＳＴｓ筛选结果，　ｍ嚣ｑ：：　“冀　身∞酶　豫“雾｛：“怒　　４一　一一一　图２组织切片ＨＥ染色（×１０ｏ）　Ａ：正常胃黏膜组织Ｂ：高分化胃癌Ｃ：中分化胃癌Ｄ：低分化胃癌　２．３　ＲＴ—ＰＣＲ检测结果　ＥＳＴ　ＤＡ９３１８６９表达在２８例胃癌组织中阳性表　０．３１１　４－０．２０８，呈逐渐降低趋势（Ｐ＜０．０５）；在有淋　巴结转移的胃癌中相对表达强度仅为０．２６６　４－　０．１４２，与无淋巴结转移组０．６５２　４－０．１３３比较，差异　有显著性（Ｐ＜０．０５）；ＥＳＴ　ＤＡ９３１８６９　ｍＲＮＡ表达与　患者性别、年龄无关（Ｐ＞０．０５）。　达率为４６．４３％（１３／２８），而在正常胃黏膜组织中阳　性表达率为８９．２８％（２５／２８），两者比较差异有显著　性（Ｐ＜０．０５）（见图３）。其阳性表达率在高、中、低　分化的胃癌中分别为８３．３３％（５／６）、５７．１４％（４／　７）、２６．６７％（４／１５），三者差异均有显著性（均Ｐ＜　０．０５）；在有淋巴结转移胃癌阳性表达率为３０．７７％　（４／１３），低于无淋巴结转移胃癌阳性表达率　６０．００％（９／１５），两者比较差异有显著性（Ｐ＜　０．０５）。在男性和女性患者中的阳性表达率分别为　４４．４４％和５０．００％（Ｐ＞０．０５），在小于５Ｏ岁和大于　５０岁组中阳性表达率分别为４４．４４％和４７．３７％（Ｐ　＞０．０５）。　圜　图３　ＥＳＴ　ＤＡ９３１８６９　ＲＴ—ＰＣＲ结果　Ｍ：ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１，３。５。７，９：正常胃黏膜组织；２，４，６，８，１０：胃癌组　织　ＥＳＴ　ＤＡ９３１８６９　ｍＲＮＡ表达水平在高、中、低分　化的胃癌中分别为０．７９９±０．１６７、０．５５０　４－０．１１２、　２０８　而其余三条ＥＳＴ　ＣＲ７４５５３１、ＥＳＴ　ＢＧ７５２９１６、　ＥＳＴ　ＡＩ１２５３４０，在２８例胃癌组织中阳性表达率均在　８５％以上（分别为８９．２８％、８５，７ｌ％、９２．８６％），在　相应正常胃黏膜组织中阳性表达率均在９０％以上　（分别为９６．４２％、９２．８６％、９６．４８％）。其相对表达　强度经统计学分析，差异无显著性（Ｐ＞Ｏ．０５）。　３　讨　论　随着人类基因组计划（ＨＧＰ）的顺利实施，分子　生物学的发展，肿瘤相关基因的克隆和鉴定已成为　现代肿瘤学的研究重点之一。与人类其它的恶性肿　瘤相同，胃癌是由多种基因变化累积所致的多基因　病。原癌基因的激活和／或抑癌基因的失活是最常　见的基因改变，二者通过影响细胞分化、凋亡、细胞　周期调节等事件，参与胃癌的发生发展过程。目前　研究认为，胃癌的发生发展过程中，抑癌基因失活可　能比癌基因激活更为重要。而抑癌基因失活，与染　色体杂合性缺失、基因突变或基因启动子区域高甲　基化等相关。现代分子遗传学研究证实，胃癌存在　多条染色体位点的纯合性缺失与杂合性缺失，已确　定的纯合性缺失或杂合性丢失位点，分布于多条染　色体的多个区带，如１７ｐｑ、７ｑ３１和８ｐ２２等　。　大量研究表明，胃癌染色体８ｐ区域常常发生高　频率的非随机性杂合性丢失。高频杂合性缺失位　点，往往有抑癌基因存在。Ｆｒｅｎｃｈ等　通过检测异　种移植胃癌组织中８ｐ的典型标志物，发现８ｐ存在　较高的等位基因失衡（Ａｌｌｅｌｉｅ　Ｉｍｂａｌａｎｃｅ，ＡＩ）率。　Ｂａｆｆａ等　运用微卫星标记法，检测胃癌组织中杂合　性丢失情况，结果显示８ｐ２１—２２区域存在高频率杂　合性缺失，推’狈４该区域可能存在某个或某些与胃癌　发生发展相关的未知抑癌基因。随后，Ｖｅｃｃｈｉｏｎｅ　等　在８ｐ２２区域发现一个胃癌相关新抑瘤基因　Ｆｅｚｌ，此基因在某些胃癌组织中通过基因组缺失、突　变或超甲基化而失活，且Ｆｅｚ１与胃癌远处转移存在　重要相关性。这些资料，为在这个区域克隆出在胃　癌发病过程中起关键作用的基因提供了有力依据。　因此，８ｐ２１—２２区域成为本文克隆ＧＣ相关基因的　首选染色体区域。　本文ＲＴ—ＰＣＲ结果提示胃癌组织中存在ＥＳＴ　ＤＡ９３１８６９的表达下调和缺失，其表达下调和缺失与　肿瘤分化程度及淋巴转移相关，而与患者性别和年　龄无关。表明ＥＳＴ　ＤＡ９３１８６９　ｍＲＮＡ相对表达强度　与肿瘤分化程度正相关，与肿瘤淋巴结转移负相关。　ＥＳＴ序列是基因表达的短ｃＤＮＡ序列，是基因　的部分外显子序列，但携带着完整基因中的表达信　息。ＥＳＴ的大规模测序是人类基因组计划构建转录　图谱的重要组成部分，随着人类基因转录图谱中　ＥＳＴ数目上的迅猛递增及其在染色体上的精确定　位，ＥＳＴ已成为定位克隆人类新基因（包括未知抑癌　基因）的重要手段。ＥＳＴ的表达水平，代表该基因在　某一组织或肿瘤组织的表达水平¨０］。本研究正是　采用这一策略，从ＧＣ高频率ＬＯＨ位点８ｐ２１—２２区　域的ＥＳＴｓ着手，运用ＲＴ—ＰＣＲ方法，筛选出一个胃　癌相关的差异表达ＥＳＴ（ＤＡ９３１８６９），为寻找与克隆　胃癌发生过程中的相关新基因奠定了基础。　参考文献：　［１］Ｄｒｅｂｂｅｒ　Ｕ，Ｂａｌｄｕｓ　ＳＥ，Ｎｏｌｄｅｎ　Ｂ，ｅｔ　１ａ．Ｔｈｅ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓ－　ｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ—ｍｅｔ　ａｓ　ａ　ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒ　ｆｏｒ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｒｃｉ－　ｎｏｍａ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｐ５３　ａｎｄ　ｐ２　１　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　［Ｊ］．Ｏｎｃｏｌ　Ｒｅｐ，２００８，１９（６）：１４７７—１４８３．　［２］　Ｋａｉｚａｋｉ　Ｒ，Ｙａｓｈｉｒｏ　Ｍ，Ｓｈｉｎｔｏ　Ｏ，ｅｔ　ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆＥ－　Ｒａｓ　ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｉｎ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，　２００９，２９（６）：２１８９～２１９３．　［３］Ｖｕｋｏｂｒａｔ—Ｂｉｊｅｄｉｃ　Ｚ，Ｒａｄｏｖｉｃ　Ｓ，Ｈｕｓｉｃ—Ｓｅｌｉｍｏｖｉｃ　Ａ，　ｅｔ　ａ１．Ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｒ　ｇｅｎｅ　ｐ５３　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｐｒｅｍａｌｉｇ—　ｎａｎｔ　ｌｅｓｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ—ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ　Ｖａｈｌｅ　［Ｊ］．Ｂｏｓｎ　Ｊ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄ　Ｓｃｉ，２００７，７（１）：７一ｌ０．　［４］　Ｗａｎｇ　Ｄ，Ｆａｎｇ　Ｄ，Ｌｕｏ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｈｅｔ—　ｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ　ａｔ　ＤＣＣ　ａｎｄ　ＡＰＣ／ＭＣＣ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｌｏｃｉ　ｏｆ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ　Ｍｅｄ　Ｓｃｉ　Ｊ，１９９９，１４（２）：１０７—１１１．　［５］Ｂａｆａ　Ｒ，Ｓａｎｔｏｒｏ　Ｒ，ＢｕｌＭｃｈ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｉｆｎｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅ・　ｆｉｎｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　８ｐ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉ—　ｔｙ　ｉｎ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃｈｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２０００，６：１３７２　—１３７７．　［６］Ｙｕ　Ｊ，Ｚｈｏｕ　Ｈ，Ｊｉｎ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｒｅｅ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ｌａ—　ｌｅｌｉｃ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｏｎ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１７　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｓｐｏｒａｄｉｃ　ｇａｓ－　ｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００８，５５（８５）：　１４８７—１４９１．　［７］Ｘｉａ　ＪＣ，Ｗｅｎｇ　ＤＳ，Ｌｉ　ＪＴ，ｅｔ　ａ１．Ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ　ａ—　ｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｌｃｏｕｓ　ａｔ　７ｑ３１［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅｔ　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ，２００６，１６６　（２）：１６６—１７２．　［８］　Ｖｅｃｃｈｉｏｎｅ　Ａ，Ｉｓｈｉｉ　Ｈ，ｓｌ１ｉａｏ　ＹＨ，ｅｔ　ａ１．Ｆｅｚｌ／ｌｚｔｓｌ　ａｌｔｅｒ－　ａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｇａｓｔｉｒｃ　ｃａｃｒｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００１，　７：１５４６—１５５２．　［９］Ｆｒｃｎｃｈ　ＡＪ，Ｐｅｔｒｏｎｉ　Ｇ，Ｔｈｉｂｉｄｅａｕ　ＳＮ，ｅｔ　ａ１．ＡＵｅｌｉｅ　ｉｍ—　ｂａｌａｎｃｅ　ｏｆ　８ｐ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｐｏｏｒ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｉｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ　［Ｊ］．Ｊ　Ｍｏｌ　Ｄｉａｎｇ，２００４，６（３）：２４３—２５２．　［１０］　Ｃｌａｖｅｒｉｅ　ＪＭ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ａｎｄ　ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．　Ｈｕｍ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ，１９９９，８（１０）：１８２１—１８３２．　（此文编辑蒋湘莲）　２０９