一种产N-乙酰神经氨酸重组微生物的构建方法及应用[发明专利]

2024-07-28 作者:

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104878035 A

(43)申请公布日(43)申请公布日 2015.09.02

(21)申请号 8.5(22)申请日 2015.04.20

(71)申请人江南大学

地址214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道

1800号(72)发明人陈献忠 周俊波 杨海泉 沈微(51).

C12N 15/70(2006.01)C12N 15/61(2006.01)C12N 15/60(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12P 19/26(2006.01)

权利要求书1页 说明书3页 附图2页

(54)发明名称

一种产N-乙酰神经氨酸重组微生物的构建方法及应用(57)摘要

本发明公开了一种产N-乙酰神经氨酸重组微生物的构建方法及应用。通过密码子优化、基因克隆等分子生物学技术分别构建了表达N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因的两株重组大肠杆菌。两株重组微生物经诱导培养、按一定比例混合后，能够高效的生产N-乙酰神经氨酸。以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸钠为底物，以两株重组微生物作为全细胞为催化剂，经催化反应后N-乙酰神经氨酸产量可达260mM(80.5g/L)，最高底物转化率达43.3％。

C N

1 0 4 8 7 8 0 3 5

A CN 104878035 A

权 利 要 求 书

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1.一种重组微生物催化生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于分别表达N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因slr1975*和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因nanA；

所述N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因来源于集胞藻(Synechocystis sp.)PCC 6803，核苷酸序列如GenBank登陆序列号：NC_000911.1所示；

所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因来源于大肠杆菌K12(Escherichia coli)，核苷酸序列如GenBank登陆序列号：NC_000913.3所示；

所述的微生物宿主是 BL21(DE3)。

2.权利要求1所述的N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因slr1975*是经密码子优化后的DNA序列。

3.权利要求1所述的重组微生物，其特征在于单独表达N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因的重组微生物和单独表达N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因的重组微生物。

4.权利要求1-3所述的重组微生物，其特征在于所述N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因采用诱导表达载体pET28a进行表达。

5.权利要求1-4所述的表达N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因重组菌的构建方法，具体步骤如下：

1)将经密码子优化后的slr1975*基因和pET-28a(+)载体用限制性内切酶NdeI和EcoRI进行酶切，并通过连接反应将slr1975*基因插入质粒pET-28a(+)的NdeI和EcoRI位点之间，获得重组质粒pET-28a(+)-slr；

2)将nanA基因和pET-28a(+)用限制性内切酶NdeI和EcoRI进行酶切，并通过连接反应将nanA基因插入质粒pET-28a(+)的NdeI和EcoRI位点之间，获得重组质粒pET-28a(+)-nanA；

3)将质粒pET-28a(+)-slr和pET-28a(+)-nanA分别转化，分别得到重组微生物/pET-28a(+)-slr和/pET-28a(+)-nanA。

6.应用权利要求1所述重组微生物，N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因利用IPTG分别进行诱导表达，其特征在于诱导培养基为LB培养基，诱导表达温度为28℃，诱导表达时的细胞浓度OD600为0.6，诱导表达时间为10h。

7.权利要求1所述的生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于所述的重组微生物催化效率与酶活力存在特定的关系，优化后的酶活力比值为3:1(N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶：N-乙酰神经氨酸醛缩酶)，所述的催化反应底物N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸钠的浓度分别为0.6M和1.6M，Triton X-100浓度为0.4％，反应温度30-37℃，反应时间在48-60h。

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说 明 书

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一种产N-乙酰神经氨酸重组微生物的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及产N-乙酰神经氨酸的重组微生物及其构建方法与应用。早在1927年，美国的Landsteiner等人就发现特定的动物脂质制各物中含有类似糖的组分，它可以与Bial’s试剂反应呈紫色。之后，Klenk等人用温和的方法分别裂解脑糖脂和颌下腺粘蛋白，从中分离出与Bial’s试剂反应呈紫色的物质，将其命名为唾液酸(Sialic acid)。迄今为至，已发现唾液酸家族的成员有四十余种，其中最为重要的是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，它的含量占整个唾液酸家族的99％以上，人们对它的研究也更为深入。一般所说唾液酸的商业化生产即为Neu5Ac的工业规模制备，主要包括：从天然材料提取、化学合成、酶法合成以及微生物发酵等方法。

[0002]

唾液酸以糖复合物的形式广泛存在于动物细胞表面，但含量相当低。自从发现唾液酸以来，人们已分别从燕窝、牛奶、禽蛋等天然原料中提取得到唾液酸。Masskam Shimatanl从酪蛋白中提取唾液酸(Masskma

States Patent,5270462,Dee.14,1993)。Martin等从燕窝中提取到了唾液酸(Martin

JE,Tanenbaum ydrate Research,1976.423-425)。2003年，Koketsu对乌骨鸡鸡蛋中唾液酸的含量进行了研究，在温和酸性条件下加热至70℃-90℃发现从单个鸡蛋中提取的唾液酸含量约为218mg(Koketsu h Poultry Science,2003,44:145-148)。但唾液酸在天然原料中含量极低，分离纯化过程比较复杂且收率低，因而难于满足工业化生产的需要。

[0003]

化学法合成唾液酸反应条件苛刻，需要铟等贵重金属作为催化剂，反应步骤繁多。例如在酸性醇溶液中，α-溴甲基丙稀酸在铟的催化作用下对N-乙酰甘露糖胺进行丙烯基化反应，再对得到的产物进行臭氧化反应即可得到N-乙酰神经氨酸(Chan T H,Lee M

l of Organic Chemistry,1995,60:4228-4232)。但是，化学合成法涉及到复杂的基团保护和去保护步骤以及环境保护等问题，特别是产率偏低，故在应用过程受到限制。[0004]

N-乙酰神经氨酸的酶法合成主要以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸为底物，在N-乙酰神经氨酸醛缩酶(Neu5Ac aldolase)的催化下生成N-乙酰神经氨酸。为了克服N-乙酰甘露糖胺价格昂贵的问题，人们通过碱性条件或使用N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶(GlcNAc

2-epimerase)使廉价的N-乙酰葡萄糖胺转化为N-乙酰甘露糖胺。[0005]

近几年来，研究人员将重组表达N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的两种大肠杆菌细胞作为生物催化介质，转化GlcNAc生产Neu5Ac(Isafomi

Maru,Jua Ohnishi,lof Bioscience and Bioscience,2002,93(3):258-265)。这种方法不用分离纯化酶，同时由 于细胞膜的保护，酶相对更稳定，辅助因子容易再生。

[0001]

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组微生物催化生产N-乙酰神经氨酸的方法，所述重组菌为是克隆12基因组中N-乙酰神经氨酸醛缩酶nanA基因和来源于集胞藻(Synechocystis sp.)的N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶slr975基因并经过密码子

[0006]

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说 明 书

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优化后构建而成的重组。

[0007]

所述的N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因来源于集胞藻(Synechocystis sp.)PCC

6803，核苷酸序列如GeneBank登陆序列号：NC_000911.1所示；所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因来源于 K12，核苷酸序列如GeneBank登陆序列号：NC_000913.3所示；[0008]

将N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因nanA和密码子优化后的N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因slr975分别连接到载体pET-28a(+)上。

[0009]

本发明还提供了一种构建产N-乙酰神经氨酸基因工程菌的方法，将slr1975基因片断和pET-28a(+)用限制性内切酶NdeI和EcoRI进行酶切，并通过连接反应将slr1975基因片断插入质粒pET-28a(+)的NdeI和EcoRI位点之间，获得重组质粒pET-28a(+)-slr；将nanA基因片断和pET-28a(+)用限制性内切酶NdeI和EcoRI进行酶切，并通过连接反应将nanA基因片断插入质粒pET-28a(+)的NdeI和EcoRI位点之间，获得重组质粒pET-28a(+)-nanA；将重组质粒pET-28a(+)-slr和pET-28a(+)-nanA分别转化转化，分别得到重组微生物/pET-28a(+)-slr和/pET-28a(+)-nanA。[0010]

所述重组菌诱导表达条件：N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因利用IPTG分别进行诱导表达，其特征在于诱导培养基为LB培养基，诱导表达温度为28℃，诱导表达时的细胞浓度OD600为0.6，诱导表达时间为10h；[0011]

本发明提供的生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于所述的重组微生物催化效率与酶活力存在特定的关系，优化后的酶活力比值为3:1(N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶：N-乙酰神经氨酸醛缩酶)，所述的催化反应底物N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸钠的浓度分别为0.6M和1.6M，Triton X-100浓度为0.4％，反应温度30-35℃，反应时间在48-60h。附图说明

图1为重组质粒pET-28a(+)-nanA酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。[0013]

图2为重组质粒pET-28a(+)-slr酶切验证琼脂糖凝胶电泳图。

[0014]

图3为产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌中N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶蛋白的电泳检测结果。

[0015]

图4为全细胞催化产N-乙酰神经氨酸底物浓度优化结果。

[0012]

具体实施方式

[0016]

实施例1、重组质粒pET-28a(+)-slr的构建

[0017]

根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)公布的集胞藻(Synechocystis

6803)AGE编码基 因slr1975(ID：954945)序列，利用 Codon Usage Analysis 2.0软件对该序列进行密码子分析和优化。根据优化后的DNA序列合成目的基因，该基因命名为slr1975*。目的基因合成时在两端增加NdeI和EcoRI酶切位点，合成后插入载体质粒pET-28a(+)多克隆位点EcoRI和NdeI之间。

[0018]

用于扩增slr1975*基因的引物：SlrF：5'-GGAATTCCATATGATGATTGCCCATCGCCGT

CA-3'；SlrR：5'-CCGGAATTCTTAAGAAACCGGCAGTTGC-3'

[0020]

N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因是利用人工合成基因slr1975*作为模版进行

[0019]

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说 明 书

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PCR扩增而得。将slr1975*基因片断和pET-28a(+)用限制性内切酶NdeI和EcoRI进行酶切，并通过连接反应将slr1975*基因片断插入质粒pET-28a(+)的NdeI和EcoRI位点之间，获得重组质粒pET-28a(+)-slr。[0021]

实施例2、重组质粒pET-28a(+)-nanA的构建[0022]

用于扩增nanA基因的引物：NanAF：5'-GGAATTCCATATG ATGGCAACGA[0023]

ATTTACGTGG-3'；NanAR：5'-CCGGAATTC TCACCCGCGCTCTTGCATCAA-3'

[0024]

N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因nanA是利用12基因组(GeneBankNC_000913.3)作为模版进行PCR扩增而得，将nanA基因片断和pET-28a(+)用限制性内切酶NdeI和EcoRI进行酶切，并通过连接反应将nanA基因片断插入质粒pET-28a(+)的NdeI和EcoRI位点之间，获得重组质粒pET-28a(+)-nanA。[0025]

实施例3、重组微生物的转化

[0026]

将重组质粒pET-28a(+)-slr和pET-28a(+)-nanA分别转化，分别得到重组微生物/pET-28a(+)-slr和/pET-28a(+)-nanA。[0027]

实施例4、重组微生物的诱导

[0028]

分别将/pET-28a(+)-slr和/pET-28a(+)-nanA单菌落接种到含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，转速200rpm；将过夜培养物以体积百分比为1％的接种量接种，当OD600至约0.6～0.8时，加入0.5mM IPTG于28℃诱导表达8h。以SDS-PAGE检测蛋白表达的结果(图3)，其中slr(43.5kDa)和nanA(33kDa)两个蛋白都有表达。[0029]

实施例5、全细胞催化制备N-乙酰神经氨酸

[0030]

将/pET-28a(+)-slr和/pET-28a(+)-nanA诱导后的细胞，分别于4℃，5000rpm，离心5min收集菌体，用100mM pH7.5Tris-HCL缓冲液洗涤2次后以相同的离心条件收集菌体。重悬于适当体积的转化底物液(100mM pH7.5Tris-HCL缓冲液；0.6M

N-乙酰葡萄糖胺；0.8M丙酮酸；0.2％TritonX-100(体积百分比浓度)中，30℃，250rpm，pH7.5，转化72h，每个12h取样及调节pH值至7.5。[0031]

将得到的转化液于12000rpm，离心5min，取上清，用0.45μm的滤膜过滤后，用HPLC检测N-乙酰神经氨酸的产量。HPLC采用chromaster日立III(DAD,RID)。色谱条件：AminexHPX-87H Column(300×7.8mm)；流动相：10mM H2SO4；流速：0.50mL/min；柱温65℃；进样量l0μL。N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)标准品购自sigma公司。[0032]

实施例6、全细胞催化制备N-乙酰神经氨酸的条件优化

[0033]

对全细胞催化反应的转化底物浓度,不同N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶活比,添加表面活性剂(Triton X-100、Tween-80、Tween-20、SDS)及表活性剂进行优化，最后得到的最优条件为：N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶活比为3:1，GlcNAc的浓度为0.6M，丙酮酸的浓度为1.6M，添加0.4％表面活性剂Triton X-100。

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说 明 书 附 图

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图1

图2

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说 明 书 附 图

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图3

图4

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