CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及其免疫原性测定

2024-07-28 作者:

CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及其免疫原性测定

文兆海;周海滢;翟少华;陈凯云;胡远;简子健

【摘 要】为了探究CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及对小鼠的免疫效果,将CDV-N重组狂犬病病毒于BSR细胞上扩毒培养 、浓缩后测定其FFD50及LD50;将浓缩后的重组病毒液与复合佐剂按一定比例混匀,按不同免疫剂量 、不同免疫方式分组免疫接种小鼠,利用ELISA试剂盒对狂犬病 、犬瘟热的特异性抗体进行定性/定量检测.结果显示,重组病毒浓缩后的FFD50值为7.85 logFFD50/0.1 mL,LD50值为7.67 logLD50/0.03 mL;免疫接种后第14天抗体阳性率达100％,小鼠血清中的特异性抗体IgG水平随着免疫剂量的递增而递增.试验结果可为CDV-N重组狂犬病病毒制备口服弱毒疫苗的进一步研究提供试验数据.

【期刊名称】《动物医学进展》

【年(卷),期】2019(040)004

【总页数】7页(P21-27)

【关键词】重组狂犬病病毒;半数荧光灶形成量;半数致死量;免疫;抗体

【作 者】文兆海;周海滢;翟少华;陈凯云;胡远;简子健

【作者单位】新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐

830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052

【正文语种】中 文

【中图分类】S852.659.5

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的以侵犯中枢神经系统为特征的一种高度致死性人兽共患传染病[1-2]。患病动物的唾液中含有大量的RV，一般通过咬伤的方式，RV经唾液进入伤口沿着外周神经向中枢神经系统进犯，一旦到达大脑神经中枢，则引发狂犬病[3-4]。而犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine distemper

virus，CDV)引起的病死率高达80%以上的一种急性高度接触性传染病，具有极强传染性[5]。目前，预防狂犬病、犬瘟热最为有效的方法就是疫苗接种，在全球范围内应用最广的就是灭活苗。DNA疫苗、弱毒活疫苗、活病毒载体苗大多还处于研发或临床试验中，灭活疫苗虽然安全性好，但对大多数发展国家及广大农村地区来说免疫成本较高，不利于广泛推广应用[6-7]。弱毒活疫苗相对灭活疫苗来说，其免疫原性好、生产成本低廉，但由于弱毒疫苗在动物体内存在反毒现象，所以世界卫生组织对于弱毒疫苗主要推荐口服免疫方式，使得基因重组弱毒口服疫苗成为了众多科研工作者的研究热点。Faber M 等[8-9]构建额外增加1个或2个G基因的重组RV弱毒株，并对G基因333位进行了点突变，显著提高了G蛋白的表达量。2012年王喜军[10]构建了表达狂犬病G蛋白的重组犬瘟热病毒，免疫试验表明该重组病毒具有良好的免疫原性。2016年刘澜等[11]成功构建了表达3个G基因的重组狂犬病病毒RV-r3G株，使得G蛋白的表达量显著提高，且外周感染对小鼠的致病力降低。

本研究旨在对犬瘟热病毒N基因(Canine distemper virus N gene，CDV-N)重组狂犬病病毒的半数荧光灶形成量(fluorescence focus dose，FFD50)及半数致死量(median lethal dose，LD50)进行测定，通过不同免疫方式、不同免疫剂量免疫小鼠，摸索其最佳免疫方式及最佳免疫剂量，初步探究CDV-N重组狂犬病病毒作为犬瘟热-狂犬病二联口服弱毒疫苗株的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 3日龄乳鼠、20 g±3 g昆明小鼠，购于新疆医科大学实验动物中心。

1.1.2 细胞、毒株及其他主要材料 BSR细胞，新疆天康生物股份有限公司惠赠；CDV-N重组狂犬病病毒，由本研究团队构建、拯救并于新疆农业大学动物病理实验室保存；狂犬病阳性血清，长春兽医研究所产品；FITC标志的兔抗犬IgG，北京博奥森公司产品；MRC血清，江苏恩莫阿赛生物技术有限公司产品；DMEM培养基、胰酶替代物、双抗，美国Gibco公司产品；Amicon Ultra超滤管，Merck公司产品；小鼠狂犬病抗体IgG定量检测试剂盒购，美国4adi公司产品；小鼠犬瘟热抗体IgG定量检测试剂盒，上海酶免公司产品；小鼠狂犬病抗体IgG定性检测试剂盒、小鼠犬瘟热抗体IgG定性检测试剂盒，上海酶联生物公司产品；灌胃针、无菌注射器，新疆子奇生物公司产品。

1.1.3 主要仪器 LSM800激光共聚焦显微镜，德国ZEISS公司产品；Galaxy170R

CO2培养箱，德国Eppendorf公司产品；酶标仪，美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 重组狂犬病病毒的扩毒、浓缩及滴度测定 将拯救成功的重组病毒按同步接毒的方法进行扩毒培养：①待BSR细胞长满时，弃液，PBS清洗3遍后加入胰酶替代物消化细胞。②将重组病毒液按1∶3的量添加至BSR细胞悬液中(即将2 mL的重组病毒液加入含6 mL细胞悬液的75 cm2的细胞培养瓶中)，于37℃、体积分数为5% CO2培养箱中放置1 h，每10 min感作一次。③向感作后的病毒细胞混合液中添加适量的含30 mL/L血清的完全培养液均分到2个培养瓶中，于37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养48 h后，于-20℃冰箱中反复冻融4次后收毒，以待后续浓缩。

重组狂犬病病毒的浓缩：①将回收的病毒液分装到50 mL的离心管中，4℃、2

000 r/min离心15 min沉淀细胞碎片;②用一次性无菌注射器吸取上清，经0.22

μm的细菌滤器过滤;③转移滤液至超滤管中，4℃、6 000 r/min离心20 min～60 min，收集浓缩病毒液。

浓缩重组病毒的滴度测定：将浓缩后的重组病毒液倍比稀释至10-10(即100～10-10)，取10-4～10-10进行试验，消化细胞，铺板，同步接毒；40 mL/L多聚甲醛溶液固定细胞，PBS洗板3次；50 g/L脱脂奶粉封闭细胞，PBS洗板3次；加入1∶1 000配比的一抗感作，PBST洗板3次，再加二抗结合，PBST洗板3次；最后滴加适量80%甘油保护荧光；倒置荧光显微镜观察、计数。利用Reed &

Muench法计算FFD50，公式如下：

感染起始稀释度对数与50%感染终点稀释度对数之差，(50%-低于50%感染的百分数)/(高于50%感染的百分数-低于50%感染的百分数)×倍比稀释的对数

1.2.2 浓缩重组病毒的半数致死量测定试验 ①将浓缩后的病毒液按100～10-10作倍比稀释，将3日龄乳鼠按10-1 ～10-10滴度分成10组，每组10只进行试验，取10只乳鼠接种DMEM培养基作对照组;②碘酊、酒精涂抹消毒后，用微量注射器吸取病毒液0.03 mL/只乳鼠脑内注射;③连续21 d观察各组乳鼠的死亡情况并统计，按Reed-Muench法计算LD50。公式如下：

LogLD50=高于50%病毒稀释倍数+距离比×稀释系数的对数。

距离比=(高于50%死亡的百分数-50%)/(高于50%死亡的百分数-低于50%死亡的百分数)

1.2.3 小鼠按不同免疫剂量、不同免疫方式进行分组免疫 分组情况如下：第1组为复合佐剂50 μL+病毒液50 μL，第2组为复合佐剂150 μL+病毒液150 μL，第3组为复合佐剂300 μL+病毒液300 μL，第4组为复合佐剂50 μL+病毒液50

μL，第5组为复合佐剂150 μL+病毒液150 μL，第6组为复合佐剂300 μL+病

毒液300 μL，第7组为亲本毒株SRV9口服600 μL作为对照。具体情况如表1所示。

表1 实验动物分组、免疫和检测时间表Table 1 Grouping,immunization and

testing schedules of laboratory animals组别Groups免疫方式Immune

mode免疫次数/次Immunization times试验动物数量Number of

experimental animals免疫剂量/μLImmunizing dose免疫时间/dImmune

time检测时间/dDetection time第1组 First group口服 Oral

administration341000,7,147,14,21,35,49第2组 Second group口服 Oral

administration343000,7,147,14,21,35,49第3组 Third group口服 Oral

administration346000,7,147,14,21,35,49第4组 Fourth group注射

Injection341000,7,147,14,21,35,49第5组 Fifth group注射

Injection343000,7,147,14,21,35,49第6祖 Sixth group注射

Injection346000,7,147,14,21,35,49第7组 Seventh group口服 Oral administration346000,7,147,14,21,35,49

复合免疫佐剂(分别将氢氧化锌0.8 mg、细菌脂多糖100 μg、甘露低聚糖10 mg、枸杞多糖50 mg加入1 mL蒸馏水中溶解混匀)与浓缩病毒液按1∶1混匀，通过灌喂和腿部肌肉注射的方式免疫小鼠。分别于免疫接种后第7天、第14天、第21天、第35天、第49天进行断尾采血，静置离心，吸取血清，严格按照ELISA试剂盒的说明进行操作，对免疫后小鼠血清中特异性抗体IgG水平进行检测。

免疫期间每天观察各组小鼠有无狂犬病的临床表现，有无死亡情况，如有小鼠死亡则对其进行病理剖检及病理组织学检查，查找死亡原因。

2 结果

2.1 浓缩重组病毒的滴度测定结果

如表2所示，根据不同视野下细胞的感染数，代入Reed & Muench公式计算

FFD50的值等于10-7.85，即50%感染终点稀释度(FFD50)=10-7.85。

表2 重组狂犬病病毒感染细胞的百分比Table 2 Percentage of cells infected

with recombinant rabies virus病毒稀释倍数Virus dilution 含感染细胞的视野数Visual field number of infected cells含感染细胞的视野Visual field

number of infected cells不含感染细胞的视野Field of vision without infected

cells含感染细胞视野的百分比Percentage of visual field with infected

cells10-410/1059059/59=100%10-510/1049049/49=100%10-610/1039039/39=100%10-710/1029029/29=100%10-89/1019119/20=95%10-96/10949/13=69%10-103/10373/10=30%

2.2 浓缩重组病毒液的半数致死量(LD50)测定结果

经21 d观察乳鼠的死亡情况如表3所示，按Reed-Muench计算重组病毒的LD50。LogLD50=高于50%病毒稀释倍数+距离比×稀释系数的对数=-7+0.67×(-1)=-7.67，LD50=10-7.67/0.03 mL；即将重组浓缩病毒稀释10-7.67倍，取0.03 mL脑内接种3日龄乳鼠可以使其死亡一半。

2.3 小鼠免疫效果检测结果

2.3.1 ELISA检测试剂盒定性检测结果 利用小鼠狂犬病抗体IgG定性检测试剂盒、小鼠犬瘟热抗体IgG定性检测试剂盒分别对免疫前及免疫后第14天的小鼠血清狂犬病抗体IgG、犬瘟热抗体IgG进行定性检测，结果表明免疫前小鼠血清中狂犬病抗体IgG、犬瘟热抗体IgG均为阴性符合实验要求，免疫后第14天抗体阳性率为100%，即CDV-N重组狂犬病病毒可以同时诱导机体产生狂犬病特异性抗体IgG、犬瘟热特异性抗体IgG，与预期结果相符。

2.3.2 ELISA法制作小鼠血清抗体IgG标准曲线 由已知不同浓度的小鼠犬瘟热标准抗体IgG，通过小鼠犬瘟热抗体IgG定量检测试剂盒测定不同浓度标准抗体样品的OD值，利用Excel软件制作其标准曲线，得到直线回归方程y=187.6x-

31.324，相关系数R2=0.996 2(图1所示)。

表3 重组狂犬病病毒LD50的测定结果Table 3 Determination of recombinant

rabies virus LD50病毒稀释倍数Virus dilution 动物数量Number of animals死亡动物数量Number of dead animals存活动物数量Number of living

animals死亡动物数量的百分比/%Percentage of dead animals10-------71030-10100100

图1 小鼠犬瘟热抗体IgG检测试剂盒标准曲线Fig.1 The standard curve of the test kit for mouse canine distemper antibody IgG

由已知不同浓度的小鼠狂犬病标准抗体IgG，通过小鼠狂犬病抗体IgG定量检测试剂盒测定不同浓度标准抗体样品的OD值，利用Excel软件制作其标准曲线，得到直线回归方程y=4.841 1e1.130 1x，相关系数R2=0.986 9(图2所示)。

图2 小鼠狂犬病抗体IgG检测试剂盒标准曲线Fig.2 The standard curve of mouse rabies antibody IgG detection kit

2.3.3 小鼠血清犬瘟热抗体水平ELISA检测结果 由表4可知，第7天至第49天，第3组小鼠血清犬瘟热抗体IgG水平均显著高于第1组(P<0.05)。

由表5可知，无论是第7天、14天还是35天，第6组小鼠血清犬瘟热抗体IgG水平均极显著高于第4组(P<0.01)，而到第49天时，3个组之间小鼠血清犬瘟热抗体IgG水平无明显差异(P>0.05)。

2.3.4 小鼠血清狂犬病抗体水平ELISA检测结果 由表6和表7可知，不同剂量的口服组和注射组免疫小鼠血清狂犬病抗体IgG水平在不同时期，高剂量组均极显著高于低剂量组(P<0.01)，且随着免疫时间的增加，抗体水平呈现上升趋势。

由表8可知，相同剂量的不同免疫组小鼠血清狂犬病抗体IgG水平,无论是第7天、14天、35天还是49天，重组病毒口服组、重组病毒注射组狂犬病抗体IgG水平

均极显著高于SRV9亲本毒株口服组(P<0.01)。但在35天和49天时，600 μL重组病毒口服组和600 μL重组病毒注射组抗体水平无显著差异(P>0.05)。

2.3.5 免疫期内各组小鼠死亡情况的观察结果 各重组病毒口服免疫组、600 μL亲本毒株SRV9口服免疫组、100 μL及300 μL重组病毒注射免疫组均未发现异常表现、亦无小鼠死亡。但发现600 μL重组病毒注射组的2只小鼠在第3次免疫(第14天)前表现出狂躁、乱咬等异常行为，第3次免疫注射后2只小鼠均表现出异常兴奋，约1 h后转为精神沉郁、目光呆滞、后躯瘫痪，抽搐而死。对死后两只小鼠进行系统病理剖检，其心、肝、脾、肺、肾均未见异常。采其脑组织制作病理组织切片观察，发现大量的神经细胞胞体内出现了嗜酸性包涵体——内基氏小体(图3)，病理组织学证实该2只小鼠均死于狂犬病。

表4 不同口服剂量组小鼠犬瘟热抗体IgG检测结果Table 4 The results of IgG

detection of canine distemper antibody IgG in mice with different oral

doses ng/mL组别Groups第7天Seventh day第14天Fourteenth day第21天Twenty-first day第35天Thirty-fifth day第49天Forty-ninth day第1组

First group1.50±2.29a6.13±0.31A15.19±1.70a30.83±1.47A35.33±1.89A第2组 Second group4.12±1.207.38±1.15a18.26±1.07b

37.39±1.39A44.83±1.99B第3组 Third

group6.62±1.10b9.36±0.54Bb22.70±0.55c52.53±4.28B46.40±0.92B

注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。

Note:In the same column,values with different capital letter superscripts

mean extremely significant difference (P<0.01); And with different small

letter superscripts mean significant difference (P<0.05); While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

表5 不同注射剂量组小鼠犬瘟热抗体IgG检测结果Table 5 Detection results of

dog distemper antibody IgG in mice with different injection doses ng/mL组别Groups第7天Seventh day第14天Fourteenth day第21天Twenty-first day第35天Thirty-fifth day第49天Forty-ninth day第4组 Fourth

group3.44±0.84Aa8.42±0.61A19.09±2.27a33.08±0.58A44.02±0.69第5组

Fifth group6.09±0.73b9.73±0.33a21.82±1.12 55.40±4.89B58.14±11.85第6组 Sixth group7.44±1.22B12.57±1.74Bb24.48±0.09b

62.19±0.47B64.80±5.40

注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。

Note:In the same column,values with different capital letter superscripts

mean extremely significant difference (P<0.01); And with different small

letter superscripts mean significant difference (P<0.05); While with the

same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

表6 不同口服剂量组小鼠狂犬病抗体IgG检测结果Table 6 Detection results of

rabies antibody IgG in mice with different oral doses U/mL组别Groups第7天Seventh day第14天Fourteenth day第21天Twenty-first day第35天Thirty-fifth day第49天Forty-ninth day第1组 First

group15±8.5A38±10.8A77±9.0A293±5.8A385±20.5A第2组 Second

group40±4.5B93±28.1B235±14.8B624±76.4B814±15.4B第3组 Third

group73±18.7C165±38.0C482±47.7C827±23.3C952±30.3C

注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。 Note:In the same column,values with different capital letter superscripts

mean extremely significant difference (P<0.01); And with different small

letter superscripts mean significant difference (P<0.05); While with the

same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

表7 不同注射剂量组小鼠狂犬病抗体IgG检测结果Table 7 Detection results of

rabies antibody IgG in mice with different injection doses U/mL组别Groups第7天Seventh day第14天Fourteenth day第21天Twenty-first

day第35天Thirty-fifth day第49天Forty-ninth day第4组 Fourth

group28±25.2A50±32.5A101±12.5A323±9.8A 517±17.0A第5组 Fifth

group47±21.4B129±15.5B388±16.3B749±46.7B907±8.4B第6组 Sixth

group130±49.9C281±57.8C752±38.2C886±7.0C937±8.5B

注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。

Note:In the same column,values with different capital letter superscripts

mean extremely significant difference (P<0.01); And with different small

letter superscripts mean significant difference (P<0.05); While with the

same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

3 讨论

2000年-2010年来我国的狂犬病疫情呈现了快速回升的趋势，严重威胁了人类的生命安全。人类感染狂犬病主要是经发病或携带狂犬病病毒的犬咬伤、抓伤暴露所致，所以防控犬、猫及野生动物的狂犬病已变得刻不容缓[12-13]。结合发展中国家及广

表8 相同剂量的不同免疫组小鼠血清狂犬病抗体IgG水平ELISA检测结果Table

8 The results of ELISA detection of serum rabies antibody IgG in mice with

the same dose of different immune groups U/mL组别Group第7天

Seventh day第14天Fourteenth day第21天Twenty-first day第35天Thirty-fifth day第49天Forty-ninth day第3组 Third

group73±18.7A165±38.0A482±47.7A 827±23.3A 952±30.3A第6祖 Sixth

group130±49.9B281±57.8B752±38.2B886±7.0A937±8.5A第7组 Seventh

group56±38.6C142±45.2A289±29.0C424±20.2B580±25.0B

注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。

Note:In the same column,values with different capital letter superscripts

mean extremely significant difference (P<0.01); And with different small

letter superscripts mean significant difference (P<0.05); While with the

same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

图3 死亡小鼠神经细胞胞浆内的内基氏小体(HE 100×)Fig.3 The

intracytoplasmic bodies of nerve cells in dead mice(HE 100×)

大农村地区的经济情况，研制成本低廉、安全、免疫原性好的口服多联弱毒疫苗来免疫犬可以降低免疫成本，又可实现一苗多防。随着分子生物学技术的快速发展，使得越来越多的重组病毒得到了成功改造。2016年赵静[14]利用反向遗传学技术成功拯救出了表达犬瘟热病毒H基因的重组狂犬病病毒，免疫实验表明该重组病毒具有作为犬瘟热-狂犬病二联弱毒疫苗株的潜力。2017年da Fontoura

Budaszewski R等[15]成功拯救出了表达CDV糖蛋白的重组狂犬病病毒，免疫接种试验表明该重组病毒可诱发机体产生2种病原(RV、CDV)的保护性中和抗体。

本研究在CDV-N重组狂犬病病毒成功拯救的基础上，将重组病毒于BSR细胞中大量扩毒培养，并测定了其FFD50及LD50。不同免疫剂量的重组病毒口服免疫小鼠均产生了特异性抗体，49 d内的犬瘟热抗体IgG、狂犬病抗体IgG水平逐渐递增，第7、14、21天内高剂量免疫组产生的抗体水平显著高于低剂量组，但到

第49天时300 μL、600 μL口服免疫组之间抗体水平差异不显著。300 μL和600 μL口服免疫组和注射免疫组产生的狂犬病抗体IgG水平均显著高于600 μL的亲本毒株口服免疫组，表明G基因提前可以显著提高狂犬病抗体IgG的水平，与预期结果相符合。CDV-N重组狂犬病病毒口服弱毒疫苗株具有以下优点：①将RV的G基因由基因组的第4位提前至第2位，并敲除G基因的CD(CD区为RV的毒力基因)；②将CDV的N基因插入到RV基因组中，使得重组病毒具备同时表达RV G蛋白和CDV N蛋白的特性。毒力基因的敲除理论上可以进一步降低其毒力，但外源基因CDV-N的引入及G基因位置的改变是否会影响重组病毒的致病性仍需要进一步深入研究。重组病毒腿部肌肉注射免疫小鼠的试验结果表明，100 μL和300 μL腿部肌肉注射免疫不会引起小鼠发病，但高剂量组600 μL腿部肌肉注射免疫小鼠则可以引起部分小鼠发病，所以基于疫苗的安全性，口服免疫方式优于肌肉注射。就初步免疫实验结果来看，无论是低剂量还是高剂量的口服免疫组均不会引起小鼠发病，表明CDV-N重组狂犬病病毒具有作为犬瘟热-狂犬病二联口服疫苗的潜力。本研究仅进行了抗体水平测定，未进行狂犬病街毒、CDV病毒的攻毒保护试验，因此CDV-N重组狂犬病病毒口服免疫产生的抗体能否对抗RV、CDV强毒的攻击，有待后续试验证明。

参考文献：

【相关文献】

[1] Willoughby R virus[M].Principles and Practice of Pediatric Infectious Diseases (Fifth Edition).2018:1176-1181.

[2] Oswald M,Geissler S,Goepferich ing the central nervous system (CNS):a review

of rabies virus-targeting strategies[J].Mol Pharm，2017,14(7):2177-2196.

[3] 张 旭,纪森林,赵 雯,等.狂犬病病毒致病机制的最新研究进展[J].中国兽医科学,2018,48(3):295-

304.

[4] Fisher C R,Streicker D G,Schnell M spread and evolution of rabies virus:conquering new frontiers[J].Nat Rev Microbiol,2018,16(4):241.

[5] Loots A K,Mitchell E,Dalton D L,et es in canine distemper virus pathogenesis research:a wildlife perspective[J].J Gen Virol,2017,98(3):311-321.

[6] Yamada K,Ito N,Takayama-Ito M,et enic relation to the attenuation of rabies virus[J].Microbiol Immunol,2006,50(1):25-32.

[7] 谢世宏.狂犬病[M].陕西西安：陕西科学技术出版社,2005.

[8] Faber M,Pulmanausahakul R,Hodawadekar S S,et pression of the rabies virus

glycoprotein results in enhancement of apoptosis and antiviral immune response[J].J Virol,2002,76(7):3374-3381.

[9] Faber M,Li J,Kean R B,et ive preexposure and postexposure prophylaxis of

rabies with a highly attenuated recombinant rabies virus[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(27):11300-11305.

[10] 王喜军.表达狂犬病病毒G蛋白重组犬瘟热弱毒疫苗株的研究[D].北京：中国农业科学院,2012.

[11] 刘 澜,李士成,陈小云,等.重组表达 3G 蛋白狂犬病病毒株的构建及重组病毒相关特性的研究[J].中国兽医科学,2016,46(3):326-331.

[12] 冯 冉,何 朝,王凤双,等.北京市顺义区狂犬病风险评估及防控策略[J].中国媒介生物学及控制杂志,2018,29(1):83-87.

[13] 周 航,李 昱,陈瑞丰,等.狂犬病预防控制技术指南 (2016版)[J].中华流行病学杂志,2016,37(2):139-163.

[14] 赵 静.表达犬瘟热病毒H基因重组狂犬病病毒生物学特性的研究[D].广东广州：华南农业大学,2016.

[15] da Fontoura Budaszewski R,Hudacek A,Sawatsky B,et vated recombinant

rabies viruses displaying canine distemper virus glycoproteins induce protective immunity

against both pathogens[J].J Virol,2017,91(8).pii::10.1128/JVI.02077-16.