miR30a大多发性硬化症及EAE中的作用和机制对策

2024-07-29 作者:

ｍｉＲ－３０ａ在多发性硬化症及ＥＡＥ中的作用和机制研究摘要多发性硬化症（ＭｕｌｔｉｐｌｅＳｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＭＳ）是经典的中枢神经系统（ｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ，ＣＮＳ）自身免疫性脱髓鞘疾病。由于对ＭＳ的发病机制了解有限，并且缺乏敏感的生物学标记物，此病早期有效的诊断和治疗十分困难。目前认为，ＭＳ的发病主要是由于Ｔ细胞对自身的髓鞘蛋白产生了自身免疫反应，并导致一系列复杂的神经退行性改变。其中，ＣＤ４＋Ｔ辅助细胞（ＴｈｅｌｐｅｒＴｈｃｅｌｌｓ，ｃｅｌｌｓ）介导的自身免疫反应是ＭＳ发病最关键的因素。Ｔｈ细胞在不同的条件下可以分化为不同种类的Ｔ细胞亚群，包括Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｈｌ７以及Ｔｒｅｇ等。其中，Ｔｈｌ７是被发现的新型Ｔｈ细胞亚群，以能够分泌ＩＬ．１７为主要特点。目前认为１１１１７细胞在ＭＳ的病理发生过程中发挥重要作用。研究表明，ＭＳ患者外周血１１１１７细胞比例明显高于健康对照。此外，ＭＳ患者ＩＬ．２３受体及ＲＯＲｅ（调节Ｔｈｌ７分化的关键细胞因子受体和转录因子）的表达水平也高于健康对照。在ＭＳ的动物模型实验性变态反应性／自身免疫性脑脊髓炎（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＡｌｌｅｒｇｉｃ／ＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＥｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＥＡＥ）中发现，ＩＬ．１７中和抗体，可以延缓ＥＡＥ所致的神经功能障碍的发生；Ｔｈｌ７细胞缺失或１１１１７细胞数目的减少可以使小鼠对ＥＡＥ的敏感性下降。因此，调控１１１１７细胞的分化和ＩＬ．１７的分泌是治疗ＥＡＥ的关键点之一。虽然现有研究从细胞因子、受体及信号通路、转录因子层面对Ｔｈｌ７极化机制有一定程度的了解，但是，表观遗传学修饰在Ｔｈｌ７分化和ＥＡＥ中的作用，目前还知之甚少。小ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）介导的转录后基因调控是表观遗传学修饰的重要机制之一。ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ是在真核生物中发现的一类内源性的非编码ＲＮＡ，在许多人类疾病中发挥重要调节的作用，有可能作为诊断、预后生物学标记物和疾病的治疗靶标。我们通过ｍｉｃｒｏＲＮＡ的靶基因预测软件，挑选出１０６条可能调控Ｔｈｌ７分化的ｍｉｃｒｏＲＮＡ，并结合已有的ｍｉｃｒｏＲＮＡ在自身免疫性疾病病灶中表达数据分析，我们将重点研究ｍｉＲ－３０ａ在ＭＳ发生中的作用。我们将探讨ｍｉＲ－３０ａ在ＭＳ患者和ＥＡＥ小鼠外周血单个核细胞中的表达模式，ｍｉＲ．３０ａ对ＥＡＥ的治疗作用以及ｍｉＲ－３０ａ调控，ｎ１１７细胞分化的可能机制。以期为ＭＳ的诊断和治疗提供新的分子靶点，也为１１１１７细胞分化的表观遗传调控提供新的分子机制。在本研究中，我们首先采集了复发缓解型ＭＳ患者复发期和缓解期的外周血，分离外周血单个核细胞，检测了ｍｉＲ－３０ａ的表达；然后分离ＥＡＥ小鼠的外周血单个核细胞，研究了ｍｉＲ－３０ａ表达与Ｉｎ¨、ＩＬ－４、ＴＧＦ．１３和ＩＬ．１７表达的相关性；进一步，我们通过给动物注射髓鞘相关糖蛋白片段诱导其第二军医大学硕士学位论文ＣＮＳ脱髓鞘，建立了稳定的ＭＳ的动物模型，并通过尾静脉注射ｍｉＲ－３０ａ的慢病毒，检测ｍｉＲ０３０ａ对ＥＡＥ的治疗作用；最后，我们构建了ＳＯＣＳＩ和ＩＲＦ４的３’非编码区野生型和突变质粒，采用荧光素酶双报告系统研究了ｍｉＲ－３０ａ与靶基因ＳＯＣＳｌ和ＩＲＦ４的３’ＵＴＲ区的结合。主要研究结果如下：１、针对收集得到的８例ＭＳ患者和４例正常健康对照者的血液，我们采用ＥＤＴＡ抗凝，淋巴细胞分离液密度梯度离心法得到外周血单个核细胞，进一步用流式细胞分选的方法收集得到了ＣＤ４＋Ｔ细胞，细胞存活率和纯度均大于９９％。２、将采集的到的外周血单个核细胞，采用Ｒｅａｌ．ｔｉｍｅＰＣＲ检测ｍｉＲＮＡ．３０ａ表达水平的变化。发现在ＭＳ复发期和缓解期ｍｉＲ．３０ａ的表达较对照组均明显下调，具有显著的统计学差异。缓解期中ｍｉＲ－３０ａ的表达略高于复发期，但无显著的统计学差异。３、我们通过给动物注射髓鞘相关糖蛋白片段ＭＯＧ３５．５５诱导ＥＡＥ，发现小鼠从免疫第ｌｌ天开始陆续发病，潜伏期为１２．９５＋２．５天，发病率为９３．３％。死亡率为６．６７％。发病后小鼠一般情况较正常组差，表现为精神萎靡，体重减轻或增长缓Ｊ慢，皮毛不光滑，活动量减少，并出现明显的神经系统症状。４、我们分别于免疫后第１０、１６天，即ＥＡＥ发病前期和ＥＡＥ急性进展期，分离小鼠脾脏中ＣＤ４＋Ｔ细胞，检测其ｍｉＲ．３０ａ表达水平改变。结果显示，ＥＡＥ发病前期，小鼠脾脏ＣＤ４＋Ｔ细胞中ｍｉＲ．３０ａ的表达水平明显低于对照组。ＥＡＥ小鼠急性进展期ＣＤ４＋Ｔ细胞的比例及ＣＤ４＋Ｔ细胞内ｍｉＲ－３０ａ的表达水平均明显低于对照组。５、为了研究ｍｉＲ０３０ａ主要通过哪一种ＣＤ４＋Ｔ细胞发挥作用，我们采用慢性非缓解性ＥＡＥ小鼠动物模型，在ＥＡＥ急性炎症期，分离小鼠脾脏单个核细胞，检测细胞因子ＩＦＮ吖、ＩＬ－４、ＴＧＦ．１３和ＩＬ．１７ａ的表达以及ｍｉＲ－３０ａ的表达。结果发现，随着ｍｉＲＮＡ．３０ａ表达升高，ＩＬ．１７ａ的表达是下降的，两者之间的表达水平呈显著负相关。细胞因子ＩＦＮ－ｑ，、ＩＬ－４和ＴＧＦ．ｐ的表达无显著线性关系。６、为了研究ｍｉＲ０３０ａ是否对小鼠ＥＡＥ发病具有调控作用，我们构建并包装了高滴度的ｍｉＲ０３０ａ过表达病毒，尾静脉注射病毒到ＥＡＥ小鼠体内。结果发现，ｍｉＲ－３０ａ过表达病毒注射组的ＥＡＥ评分相对于对照组发病明显减轻，差异具有显著性。７、我们进一步检测ｍｉＲ０３０ａ过表达病毒注射对ＥＡＥ小鼠脊髓的病理改变的影响，通过ＦａｓｔＢｌｕｅ和ＨＥ染色，分别观察脊髓的脱髓鞘和炎症浸润程度。结果发现，ｍｉＲ．３０ａ过表达病毒注射组小鼠脊髓脱髓鞘和炎细胞浸润明显轻于对照组，统计分析显示，结果相差显著。．２．ｍｉＲ－３０ａ在多发性硬化症及ＥＡＥ中的作用和机制研究８、我们采用ｍｉｃｒｏＲＮＡ靶基因预测软件Ｔａｒｇｅｔｓａｎ和Ｓｔａｒｂａｓｅ对ｍｉＲ－３０ａ的靶基因进行预测。结果发现，ｍｉＲ－３０ａ的种子序列（ＡＣＡＡＡＵＧ）可以和Ｔｈｌ７分化相关重要转录因子ＳＯＣＳｌ和ＩＲＦ４的３’非编码区碱基序列不完全互补配对。９、我们进一步将靶基因ＳＯＣＳｌ和ＩＲＦ４的３７非编码区克隆到荧光素酶报告基因上游，并设计３’非编码区的突变体，克隆到荧光素酶报告质粒中，与ｍｉＲ－３０ａ共转染２９３Ｔ细胞，加入荧光素酶底物，检测荧光强度。结果发现，ｍｉＲ－３０ａ和含ＳＯＣＳｌ、ＩＲＦ４３７非编码区的荧光素酶报告质粒共转染组，荧光强度明显低于ｍｉＲ．３０ａ阴性对照与含ＳＯＣＳｌ、ＩＲＦ４３’非编码区的荧光素酶报告质粒共转染组，统计分析具有显著性差异。但是，ｍｉＲ０３０ａ和含ＳＯＣＳｌ、ＩＲＦ４３７非编码区突变体的荧光素酶报告质粒共转染组，荧光强度与对照组没有显著差异。本研究的重要结论如下：１、ＭＳ患者外周血单个核细胞中ｒｎｉＲ－３０ａ的表达水平较健康对照组明显下降。ＥＡＥ发病潜伏期和急性发病期，小鼠ＣＤ４＋Ｔ细胞中ｍｉＲ－３０ａ的表达水平较健康对照组均明显下降。ＥＡＥ急性发病期，ｍｉＲ－３０ａ与炎性细胞因子ＩＬ．１７ａ的表达呈负相关。ＥＡＥ小鼠在体给予ｍｉＲ－３０ａ后，可以明显缓解ＥＡＥ的发病，表现为行为学评分明显下降，脱髓鞘程度明显减轻，炎细胞浸润明显减少。ｍｉＲ－３０ａ直接与Ｔｈｌ７分化相关转录因子ＳＯＣＳｌ和ＩＲＦ４的３’非编码区结合，沉默其基因表达，提示ｍｉＲ－３０ａ可能通过此机制抑制Ｔｈｌ７分化和ＥＡＥ的进展。２、３、４、关键词ｌｍｉｃｒｏＲＮＡ，Ｔｈｌ７细胞，白介素．１７，多发性硬化症－３．第二军医大学硕士学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔｓＭｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓｉｓａｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎｄｉｓｅａｓｅｏｆｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ．Ｂｅｃａｕｓｅｏｆｌｉｍｉｔｅｄｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓａｎｄａｌａｃｋｏｆｓｅｎｓｉｔｉｖｅｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｃｒｉｔｅｒｉａ，ｔｈｅｅａｒｌｙｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓｓｔｉｌｌｄｅｐｅｎｄｓｏｎｒｅｐｅａｔｅｄｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｔｈｅｄｉｓｅａｓｅ．ＭＳｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｉｓｖｅｒｙｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ，ｉｔｉｓｔｈｏｕｇｈｔｔｈａｔｄｉｓｅａｓｅｉｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＴｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｇａｉｎｓｔｍｙｅｌｉｎａｎｔｉｇｅｎｓ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙａｂｒｏａｄｅｒｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｐｒｏｃｅｓｓ．Ａｍｏｎｇｔｈｅｍ，ＣＤ４＋Ｔｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙｈａｓｌｏｎｇｂｅｅｎａｃｃｅｐｔｅｄａｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔａｓｐｅｃｔｓｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｆｏｒｔｈｅｅａｒｌｙｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆｄｉｓｅａｓｅ．ＴｈｃｅｌｌｓｃａｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔＴｈｅｌｐｅｒｃｅｌｌｓｄｅｐｅｎｄｉｎｇｕｐｏｎｔｈｅｃｙｔｏｋｉｎｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＴｈｌ，＂ｌｈ２，Ｔｈｌ７ａ１１ｄＴｒｅｇ．Ｔｈｌ７ｃｅｌｌｓａｒｅａｎｅｗｓｕｂｓｅｔｏｆＴｈｅｌｐｅｒｃｅｌｌｓ，Ｔｈｌ７ｃｅｌｌｓｃａｎｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｓｅｃｒｅｔＩＬ－１７ａｎｄｐｌａｙａｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．ＲｅｃｅｎｔｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｓｈｏｗｎｔｈａｔｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆＴｈｌ７ｃｅｌｌｓｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｏｆＭＳｐａｔｉｅｎｔｓＷａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＩＬ一２３ｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｄＲＯＲｃ（ＣｒｉｔｉｃａｌｃｙｔｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＴｈｌ７ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）ｗｅｒｅａｌｓｏｍｕｃｈｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｓ．ＩｎＭＳａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌＥＡＥ（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＡｌｌｅｒｇｉｃ／ＡｕｔｏｉｒｎｍｕｎｅＥｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ），ｉｔＷａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇＩＬ一１７ｃｏｕｌｄｄｅｌａｙｎｅｒｖｅｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙＥＡＥ，Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｍｉｃｅｌａｃｋｉｎｇｏｆ１１１１７ｃｅｌｌｓｏｒｗｉｔｈｌｅｓｓＴｈｌ７ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｌｅｓｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏＥＡＥ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＴｈｌ７ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄＩＬ－１７ｓｅｃｒｅｔｉｏｎａｒｅｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｋｅｙｐｏｉｎｔｓｉｎＥＡＥｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＩｔｉｓｗｏｒｔｈｎｏｔｉｎｇｔｈａｔｗｅｈａｖｅａｌｒｅａｄｙｇｏｔａｃｅｒｔａｉｎｄｅｇｒｅｅｏｆｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇＴｈｌ７ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎａｔｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｌｅｖｅｌ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｒｎｌｌ７ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄＥＡＥｉｓｓｔｉｌｌｕｎｃｌｅａｒ．ＳｍａｌｌＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）－ｍｅｄｉａｔｅｄｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｅｐｉｇｅｎｅｔｉｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｍｉｃｒｏＲＮＡｉｓａｃｌａｓｓｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｎｏｎ—ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｆｏｕｎｄｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔＯｔｈｅｒｅｐｏｒｔｓ，ｍｉｃｒｏＲＮＡｉｓｃｒｉｔｉｃａｌｌｙｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎａｒａｎｇｅｏｆｈｕｍａｎｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙｓｅｒｖｅａｓｇｏｏｄｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｍａｒｋｅｒｓ，ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｍａｒｋｅｒｓｏｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｔａｒｇｅｔｓ．ＩｆｔｈｅｍｉＲＮＡｉｓｐｅｒｆｅｃｔｌｙｏｒｎｅａｒｌｙｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｔｏｉｔｓｔａｒｇｅｔ，ｉｔｃａｌｌｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｃｌｅａｖｅｔｈｅｔａｒｇｅｔｍＲＮＡ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ·４．ｍｉＲ－３０ａ在多发性硬化症及ＥＡＥ中的作用和机制研究ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｉＲＮＡｓａｒｅｕｓｕａｌｌｙｉｍｐｅｒｆｅｃｔｌｙｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｔｏｔｈｅｉｒｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ（ｓ）ａｎｄｍｏｄｕｌａｔｅｓｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｎｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｉａｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙ，ｗｅｕｓｅｄｔｈｅｏｎｌｉｎｅｍｉＲＮＡｔａｒｇｅｔ－ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄｆｏｕｎｄ１０６ｍｉｃｒｏＲＮＡｓｍｉｇｈｔｒｅｇｕｌａｔｅＴｈｌ７ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＰｒｅｖｉｏｕｓｓｔｕｄｉｅｓｓｈｏｗｎｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｏｎｅｏｆｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲ－３０ａｗａｓｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｓｅｖｅｒａｌａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓｌｅｓｉｏｎｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｍｉＲ－３０ａｉｎＴｈｌ７ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄＭＳｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｈａｓｎｏｔｂｅｅｎｒｅｐｏｒｔｅｄ．Ｏｕｒｓｔｕｄｙｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅ：１．ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆｍｉＲ－３０ａｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓｆｒｏｍＭＳｐａｔｉｅｎｔｓａｎｄＥＡＥｍｉｃｅ；２．ｔｈｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆｍｉＲ－３０ａｉｎＥＡＥａｎｄ３．ｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｍｉＲ－３０ａｏｎＴｈｌ７ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＥｌｕｃｉｄａｔｉｏｎｔｈｅｒｏｌｅｓｏｆｍｉＲ－３０ａｉｎＭＳ／ＥＡＥｗｉｌｌｄｅｅｐｅｎｔｈｅｋｎｏｗｌｅｄｇｅｏｆｈｏｗｔｈｉｓｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓａｎｄｈｅｌｐｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｎｅｗｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｌｅｃｕｌａｒｔａｒｇｅｔｓ，ａｌｓｏｐｒｏｖｉｄｅａｎｅｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｆｏｒｅｐｉｇｅｎｅｔｉｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＴｈｌ７ｃｅｌｌｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｆｉｒｓｔｌｙ，ｗｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｔｈｅｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｏｆＭＳｐａｔｉｅｎｔｓｄｕｒｉｎｇｒｅｌａｐｓｅａｎｄｒｅｍｉｓｓｉｏｎｐｅｒｉｏｄ，ｉｓｏｌａｔｅｄｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｍｉＲ·３０ａ．Ｔｈｅｎ，ｗｅａｎａｌｙｚｅａｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ－３０ａａｎｄｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＦＮ吖、ＩＬ－４、ＴＧＦ－１３ａｎｄＩＬ－１７ｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍＥＡＥｍｉｃｅ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｗｅｍａｄｅａｓｔａｂｌｅａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｏｆＭＳｂｙｉｎｊｅｃｔｉｉｎｇｍｙｅｌｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙｔｏｉｎｄｕｃｅＣＮＳｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ．ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｗｈｅｔｈｅｒｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｉＲ－３０ａｃａｌｌｉｎｆｌｕｅｎｃｅｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＥＡＥ，ＷｅｄｅｌｉｖｅｒｅｄｍｉＲ－３０ａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｔｏｍｉｃｅｂｙｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｔａｉｌｖｅｉｎ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｗｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄＳＯＣＳＩａｎｄＩＩⅡ４３’．ＵＴＲｗｉｌｄｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｄａｎｄｍｕｔａｎｔｐｌａｓｍｉｄ，ｕｓｅｄｕａｌ—ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｓｙｓｔｅｍｔｏｄｅｔｅｃｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｉＲ－３０ａａｎｄ３ｑ３ＴＲｏｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓＳＯＣＳ１ａｎｄＩＲＦ４．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓａｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：１）ＷｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄＥＤＴＡａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｅｄｂｌｏｏｄｆｒｏｍｅｉｇｈｔＭＳｐａｔｉｅｎｔｓａｎｄｆｏｕｒｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｓ．ＷｅｔｈｅｎｕｓｅｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｅｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｔｏｇｅｔｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｕｓｅｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｓｏｒｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄｔｏｃｏｌｌｅｃｔＣＤ４＋Ｔｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙａｎｄｐｕｒｉｔｙｗｅｒｅｃｈｅｃｋｅｄａｎｄｗｅｒｅｇｒｅａｔｅｒｔｈａｎ９９％．－５·第二军医大学硕士学位论文·６．ＢｙｕｓｉｎｇＲｅａｌ··ｔｉｍｅＰＣＲｔｏｄｅｔｅｃｔｍｉＲ··３０ａｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ，ｗｅｆｏｕｎｄｔｈａｔｍｉＲ－３０ａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｌａｐｓｉｎｇａｎｄｒｅｍｉｔｔｉｎｇＭＳｐａｔｉｅｎｔｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｍｉＲ－３０ａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｍｉｔｔｉｎｇｐａｔｉｅｎｔｓｗａｓｓｌｉｇｈｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｉｎｒｅｌａｐｓｉｎｇｐａｔｉｅｎｔｓ，ｂｕｔｎｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅＷａｓｆｏｕｎｄ．ＷｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｎｄｕｃｅｄＥＡＥｂｙｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇＣ５７ＢＬ／６ｍｉｃｅ而ｍｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｇｅｎｉｃｐｅｐｔｉｄｅＭＯＧ（３ｓ－５５）．ＴｈｅｏｎｓｅｔｏｆＥＡＥＷａｓｏｎｄａｙ１１ａｆｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ，ｔｈｅｍｏｒｔａｌｉｔｙｒａｔｅＷａｓ６．６７％ａｎｄｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｗａｓ９３．３％．ＷｅｉｓｏｌａｔｅｄｔｈｅｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓｆｒｏｍｓｐｌｅｅｎｏｆＥＡＥｍｉｃｅａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆｔｈｅｄｉｓｅａｓｅ，ｆｒｏｍｄａｙ０（ｃｏｎｔｒ０１），ｄａｙ１０（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ），ｄａｙ１６（ａｃｕｔｅＥｈＥ），ｗｅｔｈｅｎｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｍｉＲ－３０ａ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｎｍｉＲ－３０ａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｄｅｃｒｅａｓｅｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌｐｈａｓｅｏｆｔｈｅｄｉｓｅａｓｅ．ＴｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ４十ＴｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｍｉＲ－３０ａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎＣＤ４＋ＴｃｅｌｌｓｗｅｒｅｌｏｗｅｒｉｎａｃｕｔｅｐｈａｇｅｏｆＥＡＥｔｈａｎｔｈａｔｉｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｗｈｉｃｈｈｅｌｐｅｒＴｃｅｌｌｓｕｂｓｅｔＷａｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｍｉＲ－３０ａｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｗｅｕｓｅｄｔｈｅｃｈｒｏｎｉｃｎｏｎ－ｒｅｍｉｓｓｉｏｎＥＡＥｍｉｃｅｍｏｄｅｌ．ＤｕｒｉｎｇｔｈｅａｃｕｔｅｐｈａｇｅｏｆＥＡＥ，ｗｅｉｓｏｌａｔｅｄｔｈｅｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓｆｒｏｍｓｐｌｅｅｎ，ｄｅｔｅｃｔｅｄｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｏｆｍｉＲ－３０ａａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓＩＦＮ吖、ＩＬ＿４、ＴＧＦ—ｐａｎｄＩＬ一１７ａ．ＷｅｆｏｕｎｄｔｈａｔｏｎｌｙＩＬ－１７ａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｗｅｌｌ、而ｔｈｔｈａｔｏｆｍｉＲ－３０ａ．ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｗｈｅｔｈｅｒｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｉＲ－３０ａＣａｎｉｎｆｌｕｅｎｃｅｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＥＡＥ，ｗｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｅｎｃｏｄｉｎｇｐｒｅ－ｍｉＲ－３０ａ（ＬＶ－３０ａ），ｄｅｌｉｖｅｒｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｔｏｍｉｃｅｂｙｉｎｊｅｃｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｔａｉｌｖｅｉｎ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｎｔｈａｔＥＡＥｓｃｏｒｅｓｏｆＬＶ－３０ａ·ｉｎｆｅｃｔｅｄｍｉｃｅｗｅｒｅｍｕｃｈｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｃｏｎｔｒｏ】ｍｉｃｅ．ＨｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｓｅｃｔｉｏｎｓａｌｓｏｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＬＶ－３０ａ－ｉｎｆｅｃｔｅｄｍｉｃｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｍｉｌｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎａｎｄｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ，ｗｈｅｒｅａｓＬＶ－３０ａ－ＮＣ（ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒ０１）一ｉｎｆｅｃｔｅｄｍｉｃｅｓｈｏｗｅｄｐｒｏｍｉｎｅｎｔＣＮＳｐａｔｈｏｌｏｇｙ．ｍｉＲ－３０ａ在多发性硬化症及ＥＡＥ中的作用和机制研究Ｗｅｔｈｅｎｕｓｅｄｔｈｅｔａｒｇｅｔ－－ｇｅｎｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｔｓｏｆｔｗａｒｅｓＴａｒｇｅｔＳｃａｎａｎｄＳｔａｒｂａｓｅｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｔａｒｇｅｔｓｏｆｍｉＲ－３０ａ．ＷｅｆｏｕｎｄｔｈａｔｍｉＲ－３０ａｓｅｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＡＣＡＡＡＵＧ）ｃｏｕｌｄｂｉｎｄｔｏ３‘ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆＳＯＣＳ１ａｎｄＩＲＦ４（ｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎＴｈｌ７ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）ｔｈｒｏｕｇｈｉｍｐｅｒｆｅｃｔｌｙｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｐａｉｒｉｎｇ．Ｗｅｃｌｏｎｅｄｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔ３’ＵＴＲｏｆＳＯＣＳ１ａｎｄＩＲＦ４ｉｎｔｏｔｈｅｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ．Ｔｈｅｎｗｅｕｓｅｄｄｕａｌ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｓｙｓｔｅｍｔｏｄｅｔｅｃｔｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｎｔｈａｔｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆｇｒｏｕｐｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｍｉＲ－３０ａａｎｄＳＯＣＳｌ，ＩＲＦ４３’ＵＴＲｐｌａｓｍｉｄｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｅｇｒｏｕｐｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ、析ｍｍｉＲ一３０ａｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌａｎｄＳＯＣＳＩ，ＩＲＦ４３’ＵＴＲｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆｔｈｅｇｒｏｕｐｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｍｉＲ０３０ａａｎｄＳＯＣＳ１，ＩＲＦ４３‘ＵＴＲｍｕｔａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｗａｓｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｗｉｍｔｈａｔｏｆｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙａｌｅ邪ｆｏｌｌｏｗｓ：１、ｍｉＲ－３０ａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｔｈｅｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓｏｆＭＳｐａｔｉｅｎｔｓｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｉｎｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｓ．ＤｕｒｉｎｇＥＡＥｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｍｉＲ－３０ａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎＣＤ４十ＴｃｅｌｌｓＷａｓｌｏｗｅｒｉｎｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄａｃｕｔｅｐｈａｇｅｏｆＥＡＥｔｈａｎｔ１１ａｔｉｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．２、ＤｕｒｉｎｇｔｈｅａｃｕｔｅｐｈａｇｅｏｆＥＡＥ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｍｉＲ－３０ａｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｗｉｔｈｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌＬ·１７ａ．３、ｍｉＲ－３０ａｒｅｇｕｌａｔｅｄＥＡＥｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＬＶ－ｍｉＲ－３０ａｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｌｌｅｖｉａｔｅｔｈｅ‘ｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆＥＡＥ，ｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｅｈａｖｉｏｒａｌｓｃｏｒｅｒｅｄｕｃｅｄｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎａｒｅａａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｉｎＥＡＥｍｉｃｅ．４、ｍｉＲ－３０ａｄｉｒｅｃｔｌｙｂｉｎｄｔｏ３’ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆＳＯＣＳｌａｎｄＩＲＦ４（Ｔｈｌ７ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｉｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＷＯＲＤＳ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ，Ｔｈｅｌｐｅｒ１７ｃｅｌｌ，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１７，ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ－７·ＫＥＹ第二军医大学硕士学位论文缩略词表ＭＳＣＮＳＥＡＥＴｈｌ７ＩＬＦＢＳＢＳＡＰＢＳＩＦＮ．ｒＰＦＡＥＢＬＦＢ．ＰＡＳＨＥＳＯＣＳｌＩｌ疆４．８．多发性硬化症中枢神经系统实验性变应性脑脊髓炎辅助性Ｔ细胞１７白介素胎牛血清牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液ｇａｍｍａ干扰素多聚甲醛溴化乙锭快蓝．碘酸希夫苏木精．尹红染色法细胞因子信号抑制物１干扰素调节因子４ＭｕｌｔｉｐｌｅＳｃｌｅｒｏｓｉｓＣｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＥｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓＴｈｅｌｐｃｅｌｌ１７ＩｎｔｅｄｅｕｋｉｎＦｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍＢｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎＰｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｄｓａｌｉｎｅＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａｐｏｌｙｆｌｕｏｒｏａｌｋｏｘｙｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅｌｕｘｏｌｆａｓｔｂｌｕｅ·ｐｅｒｉｏｄｉｃａｃｉｄＳｃｈｉｆｆｓｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎｓｔａｉｎｉｎｇＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｌｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ４ｍｉＲ－３０ａ在多发性硬化症及ＥＡＥ中的作用和机制研究■Ｉ．＿■。刖罱ＭＳ是一种以ＣＮＳ白质脱髓鞘为主要病理特点的经典的神经免疫性疾病Ｉ¨。据统计，全世界ＭＳ患者共约１１０万，该病主要发生在青壮年，是欧美青年发病率最高的非创伤性神经疾病【１１，我国ＭＳ的患病率也呈现逐年上升趋势。此病预后不良，８５％的ＭＳ患者发病初期具有复发缓解的特征【２１，然后随着疾病的进展和神经系统的失代偿，大部分患者迸一步发展为继发进展型ＭＳ，神经功能发生不可逆的损伤，并导致瘫痪、感觉障碍、失明、癫痫发作、认知障碍等多种临床症状，极大地影响了患者的生活质量１３ｌ。每年用于治疗的花费至少数百亿美元。ＭＳ发病的免疫病理机制十分复杂，至今尚不完全明确，这已经成为目前临床治疗ＭＳ的瓶颈【４】。目前包括干扰素ｐ、糖皮质激素、那他珠单抗等在内的所有药物均不能彻底治愈ＭＳｌ４Ｉ。目前趋向于认为，ＣＤ４＋Ｔ介导的自身免疫反应是ＭＳ发病过程中最重要的因素之一１５‘６１，ＣＤ４＋Ｔ细胞的致病过程如下：首先，促炎的ＣＤ４＋Ｔ细胞在外周免疫器官中被激活，然后，这些促炎细胞穿过血脑屏障，进入ＣＮＳ实质，并攻击中枢神经细胞，导致轴突脱髓鞘【６１。在这个过程中，促炎的ＣＤ４＋Ｔ细胞主要包括Ｔｈｌ和Ｔｈｌ７细胞１７１。以前认为，Ｔｈｌ细胞可以特异性分泌干扰素ＩＦＮ－ｒ，是在自身免疫脱髓鞘疾病中发挥主要作用的Ｔ辅助细胞【８ｌ；最近，有研究报道，另外一种亚型的Ｔ辅助细胞即Ｔｈｌ７，特异性分泌ＩＬ．１７，在自身免疫性脱髓鞘疾病中发挥更为关键的作用【９】。Ｔｈｌ７的分化受细胞因子和转录因子的调控。在ＩＬ．６和ＩＬ．２３联合作用下，细胞内ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ表达水平升高，进一步启动ＲＯＲａ和ＲＯＲ丫ｔ基因，促进Ｔｈｌ７分化【１１ｌ。研究表明，ＭＳ患者外周血Ｔｈｌ７细胞比例、ＩＬ．２３受体及ＲＯＲｃ（ＲＯＲ丫ｔ的同源物）的表达水平，均明显高于健康对照。此外，有研究报道，小鼠Ｔｈｌ７细胞数目减少，特别是缺乏细胞因子ＩＬ．６、ＩＬ－２３，ＥＡＥ发病程度明显减轻【１０，１１】。因此，调控Ｔｈｌ７细胞的分化和ＩＬ．１７的分泌可能是治疗ＭＳ和ＥＡＥ的关键点。尽管目前已经从细胞因子、受体及信号通路、转录因子层面对Ｔｈｌ７分化的机制有一定程度的了解，但是，表观遗传学修饰在Ｔｈｌ７分化和ＥＡＥ中的作用，目前还知之甚少。表观遗传学修饰的重要机制之一是ｍｉｃｒｏＲＮＡ介导的转录后基因调控。来的非编码小ＲＮＡ。ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ可以结合到ＲＮＡ诱导的沉默复合体中，在转录后水平降低蛋白的表达水平１１２Ｉ，或者阻断翻译过程抑制蛋白表达。据科学研究估计，基因组中１／３的基因会受到ｍｉｅｒｏＲＮＡｓ的调控。ｍｉｃｒｏＲＮＡ在人类多种疾病中发挥调控作用［１３，１４］，可以作为潜在的诊断标志，预后标志及治疗靶标１”，阍。越来越多的研究实验－９．ｍｉｃｒｏＲＮＡ是长约２２个核苷酸，由较长的转录物经过Ｄｒｏｓｈａ和Ｄｉｃｅｒ酶剪接加工而第二军医大学硕士学位论文证明，ｍｉｃｒｏＲＮＡ可能在ＭＳ和ＥＡＥ的发病进程中发挥重要的调节作用。例如，已有相关研究报道，ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ可以调控免疫系统中多种免疫细胞的分化和功能；已经发现多种ｍｉｃｒｏＲＮＡ在ＭＳ患者外周血和病灶中表达改变；此外，小鼠体内Ｄｉｃｅｒ酶和Ｄｒｏｓｈａ酶中缺失可以使其产生自身免疫性疾病【１７ｌ；ｍｉＲ－３２６和ｍｉＲ－１５５可以调节Ｔ细胞和树突状细胞的功能，进而调控ＥＡＥ的进程【７，１叼；而ｍｉＲ－１２４则可以通过调节ＣＮＳ内抗原递呈细胞小胶质细胞的活化来调节ＥＡＥ的发病【１９】。因此，ｍｉｃｒｏＲＮＡ将是治疗自身免疫性脱髓鞘疾病的很有前景的治疗靶点。ｍｉＲ－３０ａ位于人染色体６ｑ１３，目前发现其对细胞功能具有多种调节作用，主要包括抑制细胞迁移、肿瘤侵袭和阻止细胞的自噬。Ｚｈｕ等人通过芯片研究发现，在自身免疫性疾病风湿性关节炎和系统性红斑狼疮患者及其动物模型的病灶中，均发现ｍｉＲ－３０ａ的表达下调［２０ｌ。进一步研究显示，ｍｉＲ－３０ａ在ＳＬＥ患者的Ｂ细胞中表达上调，可以促进ＳＬＥ患者Ｂ细胞的过度激活。这提示ｍｉＲ－３０ａ与自身免疫疾病的发病具有一定的相关性。我们通过ｍｉｃｒｏＲＮＡ的靶基因预测软件，发现包括ｍｉＲ－３０ａ可能调控Ｔｈｌ７分化相关重要转录因子的表达。因此我们推测，ｍｉＲ－３０ａ可能通过调控Ｔｈｌ７细胞分化，对ＭＳ和ＥＡＥ的发病也有调节作用。然而，ｍｉＲ一３０ａ在Ｔｈｌ７细胞的分化和ＭＳ的病理发生的作用，目前还未见报道。为了研究ｍｉＲ－３０ａ在Ｔｈｌ７细胞分化和ＭＳ疾病中的作用，我们收集了复发缓解型ＭＳ患者的外周血单个核细胞，通过ＲＴ－ＰＣＲ的方法，检测ｍｉＲ－３０ａ的表达。进一步对ＥＡＥ小鼠的外周血单个核细胞中ｍｉＲ－３０ａ的表达与ＩＬ．１７表达水平的相关性进行研究。然后，．我们诱导了ＭＳ的动物模型ＥＡＥ，并经ＥＡＥ小鼠尾静脉注射ｍｉＲ－３０ａ过表达慢病毒，通过神经行为学和形态学等多种手段检测ｍｉＲ．３０ａ对ＥＡＥ的治疗作用。最后，我们采用荧光素酶实验，研究ｍｉＲ－３０ａ对Ｔｈｌ７细胞分化相关转录因子ＳＯＣＳｌ和眦４表达的调节。本研究旨在探讨ｍｉＲ－３０ａ在ＭＳ患者和ＥＡＥ小鼠外周血单个核细胞中的表达模式，ｍｉＲ一３０ａ对ＥＡＥ的治疗作用以及ｍｉＲ－３０ａ调控Ｔｈｌ７细胞分化的可能机制。以期为ＭＳ的诊断和治疗提供新的分子靶点，也为Ｔｈｌ７细胞分化的表观遗传调控提供新的分子机制。．１０．ｍｉＲ－３０ａ在多发性硬化症及ＥＡＥ中的作用和机制研究材料与方法一、实验材料１．实验动物Ｃ５７／ＢＬ６小鼠购自中国科学院上海斯莱克实验动物有限公司及南京动物模式中心。动物实验遵照国家健康中心实验动物使用指南进行，并得到第二军医大学动物伦理学委员会认可。２．主要仪器３１１１细胞培养箱ＳＤＪ单人垂直净化超净工作台．ＨＨＷ２１６００Ｓ数显电热恒温水箱．Ｔｈｅｒｍｏ公司，美国上海淀山湖净化备厂，中国上海跃进医疗器械有限公司ＪＥＩＯＳ１６００Ｒ恒温摇床ＡＶＣ．６Ｄ１超净工作台ＴＥＣＨ公司，韩国ＥＳＣＯ，新加坡Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，日本ＳＺＸｌ２／９冷光源ＩＸ７０相差显微镜Ｅ６６０ＦＮ．荧光显微镜Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，日本Ｎｉｋｏｎ公司，日本Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，德国５８０４Ｒ台式高速冷冻离心机ＨｅｒａｅｕｓＰｉｅｏｌ７台式离心机Ｔｈｅｒｍｏ公司，美国Ｂｉｏ．Ｐａｄ公司，美国￥６９ＢＲｌ３６１实时荧光定量ＰＣＲ仪ＰｏｗｅｒＰａｃＨＣ蛋白电泳仪Ｂｉｏ．Ｐａｄ公司，美国ＣＭｌ９００冰冻切片机Ｌｅｉｅａ公司，德国消毒箱Ｈｉｔａｃｈｉ公司，日本ＡＲ２１３０电子天平Ｋ３０恒温孵育器￥２０台式ＰＨ计ＳＣＳ．２４细胞摇床ＭｙｌＱＳｉｎｇｌｅＣｏｌｏｒｒｅａｌ－ｔｉｍｅＯｈａｕｓ公司杭州奥盛仪器有限公司，中国ＭＥＴＴＬＥＲＴＯＬＦＤ，瑞士上海离心机研究所，中国ＰＣＲ仪Ｂｉｏ－Ｐａｄ公司，美国美天旎，德国ＭＡＣＳ磁珠分选仪３．主要耗材ｇ－军医大学硕士学位论文细胞培养所用的细胞培养瓶、细胞培养板等均购自Ｃｏｍｉｎｇ公司；硝酸纤维素膜购自Ｐａｌｌ公司；Ｘ一感光片购自Ｋｏｄａｒｋ公司４．主要试剂４．１流式抗体ＦＩＴＣＲａｔａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＣＤ４Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃａｔ５６１８３５，ＢＤ公司ＡＰＣＭｏｕｓｅａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＣＤ４Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＣａｔＨ１００４１·ｌｌＧ，三箭生物公司４．２其它试剂ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１１０３９．０２１）、ＩＭＤＭ（Ｒ１０．０１６．ＣＶ）、胎牛血清（１００９９．１４）购自Ｇｉｂｃｏ公司；０．２５％胰酶（Ｔ４０４９）、ＰＬＬ（Ｐ８９２０）购自ｓｉｇｍａ公司；青霉素一链霉素（Ｐ．Ｓ．）（Ｃ０２２２）购自碧云天公司：ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｅＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｋ１６２１）购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司：ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ购自ＴＯＹＯＢＯ公司：ＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ（１５５９６．０２６）购自Ｉｎｔｒｏｇｅｎ公司；ｍｉｒＶａｎａｍｉＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ＡＭｌ５６０）购自Ａｍｂｉｏｎ公司；ＣＤ４＋ＴｃｅｌｌｉｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（１３０．０９３．２２７）；淋巴细胞分离液（１７－５４４２．０２）：快蓝染料（￥３３８２．２５９）购自Ｓｉｇｍａ公司：ＰＡ（Ｐ０４３０．２５９）、Ｓｃｈｉｆｆ（３９５２０１６．５００ｍ１）、苏木精（ＭＨＳｌ６．５００ｍ１）均购自Ｓｉｇｍａ公司。５．常用缓冲液及试剂配制１）０．１ＭＰＢＳ（ＰＨ７．４）：ＫＣＩ２．０１９，ＫＨＥＰ０４２．４５９，Ｎａ２ＨＰ０４．１２Ｈ２０３６９，ＮａＣｌ８１．８２９，加入８００Ｍ１蒸馏水，调ＰＨ至７。４，蒸馏水定容至ｌＬ２）解剖液（１Ｌ，ＰＨ＝７．３—７．４）：ＫＣＩＯ．４９，ＫＨ２Ｐ０４０．０３９，ＮａＣＩ８９，Ｎａ２ＨＰ０４．１２Ｈ２００．０６９，Ｄ－Ｇｌｕｃｏｓｅ３．００９，蔗糖７．５９，ＨＥＰＥＳ２．３８９３）ＣＤ４＋ＴＩｓｏｌａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ：ＰＢＳ溶液，Ｏ．５％ＢＳＡ，２ｍＭＥＤＴＡ，调ＰＨ至７．２，４度保存４）４％多聚甲醛：取８０９多聚甲醛粉末加蒸馏时至ｌＬ，磁力加热搅拌２．３ｈ，加ｌｇ固体ＮａＯＨ和０．４ＭＰＢ５００ｍｌ，定容至２Ｌ５）２０％蔗糖／ＰＢ溶液：取２０９蔗糖加入Ｏ．１ＭＰＢ，定容至１００ｍｌ６）铬钒明胶溶液：取５９明胶溶于５００ｍｌ的蒸馏水中，６０＂Ｃ水浴促溶至完全溶解，无色；取１９硫酸铬钾溶于上述溶液，定容至１Ｌ，呈蓝色，４。Ｃ保存。７）５０×ＴＡＥ：２．０ＭＴｒｉｓ，１．０ＭＮａＡｅ，５０ｍＭＥＤＴＡ，ＰＨ＝８．０１０ｘＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液：Ｔａｋａｒａ附送１０ｘｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ．１２．ｍｉＲ－３０ａ在多发性硬化症及ＥＡＥ中的作用和机制研究二、实验方法１．细胞培养１．１ＣＤ４＋Ｔ细胞的培养在无菌的条件下，取Ｃ５７成年老鼠的脾脏，淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞；Ａ．３００９离心１０ｍｉｎ，弃上清，４００ｕｌｂｕｆｆｅｒ重悬细胞加入ｌＯＯｕｌＣＤ４＋ＴＣｅｌｌＢｉｏｔｉｎ－ＡｎｔｉｂｏｄｙＣｏｃｋｔａｉｌＩＩ，混匀，４℃静置１０ｍｉｎ加入３００ｕｌ的ｂｕｆｆｅｒ和２００ｕｌ的Ａｎｔｉ．ＢｉｏｔｉｎＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ，混匀，４℃静置１５ｍｉｎ加入ｌＯｍｌ的ｂｕｆｆｅｒ，３００９离心１０ｒａｉｎ，弃上清５００ｕｌｂｕｆｆｅｒ重悬细胞Ｂ．将ＬＳ柱放置到美天旎磁珠分选装置上面，３ｍｌ的ｂｕｆｆｅｒ过柱将ａ中所得细胞悬液过柱，收集过滤得到的未结合的细胞悬液３ｘ３ｍｌｂｕｆｆｅｒ过柱，收集过柱后的液体３００９离心１０ｍｉｎ，弃上清’Ｃ．８００ｕｌ的ｂｕｆｆｅｒ重悬细胞加入２００ｕｌ的ＣＤ６２Ｌ（Ｌ．ｓｅｌｅｃｔｉｎ）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ，混匀，４＂Ｃ静置１５ｍｉｎ加入１０ｍｌ的ｂｕｆｆｅｒ，３００９离心１０ｍｉｎ，弃上清５００ｕｌ的ｂｕｆｆｅｒ重悬细胞Ｄ．将ＭＳ柱放置到美天旎磁珠分选装置上面，５００ｕｌｂｕｆｆｅｒ过柱将ｃ中得到的细胞悬液过柱３ｘ５００ｕｌｂｕｆｆｅｒ过柱，丢弃过柱后的液体取下ＭＳ柱，向柱内加入ｌｍｌ的ｂｕｆｆｅｒ，用活塞迅速将柱内结合到磁珠上的细胞１．２ＴＨｌ７细胞的培养，ｍ１７细胞的诱导：将磁珠分选出来的ＣＤ４＋Ｔ细，ｂｕ仃ｅｒ重悬，３００９离心１０ｍｉｎ。ＩＭＤＭ／ＩＯ％ＦＢＳ培液重悬细胞，种到ａｎｔｉ．ＣＤ３（５ｕ∥ｍ１）抗体包被的２４孔板中，加入ａｎｔｉ—ＣＤ２８（２ｕｇ／ｍ１）、ａｎｔｉ—ＩＬ＿４（５ｕｇ／ｍ１）、ａｎｔｉ—ＩＦＮ－ｒ（５ｕｇ／ｍ１）、ＴＯＦ－ｂ（２ｎｇ／ｍ１）、ＩＬ一６（４０ｎ∥ｍ１）、１１，－２３（４０ｎｇ／ｍ１）刺激３＿４天·１３·洗出，即为ＣＤ４＋Ｔ细胞，离心用ＩＭＤＭ／１０％ＦＢＳ重悬，种植到２４孔板中。第二军医大学硕士学位论文１．３２９３Ｔ细胞的培养２９３Ｔ细胞培养在Ｔ７５培养瓶中，当细胞密度达到８０．９０％时，将细胞传代到２４孔板中进行后续试验，２９３Ｔ细胞用ＤＦｌ２／１０％ＦＢＳ培养。２．外周血单个核细胞和ＣＤ４＋Ｔ细胞的获取２．１外周血单个核细胞的获取新鲜抽取外周血，用１ＸＰＢＳ等体积稀释取５０ｍｌ离心管，并向内加入２倍血体积的淋巴细胞分离液将稀释后的血沿管壁缓慢加入淋巴分离液上层４００９，２０ｍｉｎ，缓慢减速细胞分层，用枪头将中间白膜细胞层吸出等体积的ＰＢＳ稀释，５００９，１０ｍｉｎ用适量Ｔｒｉｚｏｌ裂解细胞，．７０℃保存２．２血中ＣＤ４＋Ｔ细胞的获取离心分离得到的单个核细胞，用ｂｕｆｆｅｒ重悬，细胞分为两份，一份细胞不染色做为阴性对照，另一份用ＣＤ４流式抗体染色；１００ｕｌｂｕｆｆｆｅｒ细胞悬液，加入５ｕｌ的ＣＤ４抗体，４＂Ｃ，半个小时；加ｂｕｆｆｅｒ稀释，５００９，离心细胞，细胞沉在管底，适量ｂｕｆｆｅｒ重悬。流式上机，将ＣＤ４＋Ｔ细胞分选下来。用适量的Ｔｒｉｚｏｌ裂解细胞，．７０℃保存，用于后续试验。３．ｍｉｃｒｏＲＮＡ的抽提及逆转录为ｃＤＮＡ、ＱＰＣＲ３．１小ＲＮＡｓ抽提１）Ｔｒｉｚｏｌ裂解细胞，充分裂解后，加入１／３体积的１００％乙醇，ｖｏｔｅｘ混匀。２）将细胞裂解液过ＦｉｌｔｅｒＣａｒｔｒｉｄｇｅ，收集过滤后的液体３）加入２／３体积的１００％乙醇，ｖｏｔｅｘ混匀４）将混合物再次过ＦｉｌｔｅｒＣａｒｔｒｉｄｇｅ，丢弃过滤后的液体５）用７００ｕｌＩＩｌｉＲＮＡＷｈＳｈ６）５００ｕｌＷａｓｈＳｏｌｕｔｉｏｎ１清洗ＦｉｌｔｅｒＣａｒｔｒｉｄｇｅ，离心丢弃过滤后的液体Ｃａｒｔｒｉｄｇ，离心丢弃过滤后的液体Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２／３清洗Ｆｉｌｔｅｒ７．）空管离心ｌｍｉｎ８）加入１００ｕｌ９５℃预热的ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ，离心将小ＲＮＡｓ从ＦｉｌｔｅｒＣａｒｔｒｉｄｇ洗脱下来，．２０℃储存。．．１４．．ｍｉＲ－３０ａ在多发性硬化症及ＥＡＥ中的作用和机制研究３．２特性性逆转录１０ｕｌ逆转录体系：５ｘＢｕｆｆｅｒ２ｕｌ０．４ｕｌＯ．２５ｕｌｌｕｌｌｕｌｌｕｌ４．３５ｕｌ高效逆转录酶重组ＲＮＡ酶抑制剂ｄＮＴＰｍｉｘ茎环逆转录引物小ＲＮＡｓＤｄＨ２０基因名称ｓｎｏＲＮＡ２０２茎环逆转录引物七极Ｑ鼹鼹＋ＣＴＴＣＣＡＧＴｍｉｃｒｏＲＮＡ．３０ａ３．３ｍｉＲＮＡＱＰＣＲＧｒｅｅｎＭｉｘ反应体系：ＳＹＢＲ５ｕｌ（总体系２０ｕ１）步骤１：９５℃５ｍｉｎ１０ｕｌ；上下游引物（２ｕＭ）各２ｕｌ；ｅＤＮＡ１ｕｌ；ｄｄＩ－１２０步骤２：９５℃１５ｓ，６０℃１５ｓ，７２℃４５ｓ，４０个循环；步骤３：溶解曲线分析以ｓｎ０２０２为内参对目的基因的扩增进行标化，ｍｉｃｒｏＲＮＡ的相对表达量通过２－ｄｄｅｔ法计算获得。基因名称ＳｎｏＲＮＡ２０２引物序列Ｓｅｎｓｅ５’ＧＧＧＣＴＧＴＡＣＴＧＡＣＴｒＧＡＴＧＡ５’Ａｎｔｉ．ｓｅｎｓｅ５’ＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧ３’ＭｉｃｒｏＲＮＡ．３０ａＳｅｎｓｅ５’ＣＡＴＣＣＴＣＧＡＣＴＧＧＡＡＧ３’１５－第二军医大学硕士学位论文４．ｍＲＮＡ的抽提及逆转录为ｃＤＮＡ、ＱＰＣＲ４．１ＴＲＩｚｏＩ抽提ｍＲＮＡ及反转录成ｃＤＮＡ１）２４孔板每孔加入ｌｍｌＴｒｉｚａｌ充分裂解细胞，ＥＰ管中静置５ｍｉｎ２）１２，０００９离心５ｒａｉｎ，弃沉淀３＿）２００氯仿ｕｌ／ｍｌＴｒｉｚｏｌ加氯仿，充分混匀，室温放置１５ｍｉｎ４）４＂Ｃ，１２，０００９，离心１５ｍｉｎ，吸取上层水相到另一离心管中，不要吸取中间层５）加入等体积的异丙醇混匀，室温静置５．１０ｍｉｎ６）４＂Ｃ，１２，０００９，离心１０ｍｉｎ，弃上清，ＲＮＡ沉于管底７）加入ｌｍｌ的７５％乙醇，悬浮ＲＮＡ沉淀８）４。Ｃ，８０００９离心５ｍｉｎ，弃上清９）室温晾干或真空干燥５．１０ｍｉｎｌｏ）加入２０ｕｌＤＥＰＣ水，６０度水浴溶解１１）按照ＲｅｖｅｒＡｉｄＴＭＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＣｄｎａＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ试剂盒反转录成ｃＤＮＡ４．２ＱＰＣＲ反应体系：ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭｉｘ１０ｕｌ；上下游引物（２ｕＭ）各２ｕｌ；ｅＤＮＡｌｕｌ；ｄｄＨ２０５ｕｌ（总体系２０ｕ１）步骤１：９５℃５ｍｉｎ步骤２：９５℃１５ｓ，６０℃１５ｓ，７２℃４５ｓ，４０个循环；步骤３：溶解曲线分析以内参ＧＡＰＤＨ对目的基因的扩增进行标化，目的基因的相对表达量通过２－ｄｄｅｔ方法计算获得。相关引物序列如下：基因名称引物序列ＩＬ．１７ＡＳｅｎｓｅ５’Ｔ丌ＡＡＣＴＣＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＡ３’·１６·ｍｉＲ－３０ａ在多发性硬化症及ＥＡＥ中的作用和机制研究Ａｎｔｉ．ｓｅｎｓｅ５’ＣｒＩＴＣＣＣＴＣＣＧＣＡＴＴＧＡＣＡＣ３’ＩＦＮ．ｒＳｅｎｓｅ５’ＡｒＧＡＡＣＧＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＡＴＣ３’Ａｎｔｉ．ｓｅｎｓｅ５’ＣＣＡＴＣＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧｌ＿Ｉ℃ＣＴＣ３‘ＴＧＦ．ｂＳｅｎｓｅ５’ＣＡＣＴＧＡＩ＇ＡＣＧＣＣＴＧＡＧＴＧ３’Ａｎｔｉ．ｓｅｒｌｓｅ５。ＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＡＡｒＣＧＡＡＡ３。５．荧光素报告系统检测将ｍｉＲ．３０ａ的靶基因ＳＯＣＳｌ、ＩＲＦ４的３’ＵＴＲ以及其突变序列克隆到ＰＧＬ３载体上，克隆扩增，抽提质粒，与海参荧光素质粒、ｍｉＲ－３０ａｍｉｍｉｃｓ共转染细胞，２４．３６小时后检测细胞的荧光强度。１）转染前一天，将２９３Ｔ细胞传代到２４孔板中２）转染前将细胞培液换成ｏｐｔｉ．ＭＥＭ，－每孔５００ｕｌ，ｌｕｌｌｉｐ２０００与５０ｕｌ的ｏｐｔｉ．ＭＥＭ．混匀，室温静置５ｍｉｎ３）ＳＯＣＳｌ、ＳＯＣＳｌ突变、ＩＲＦ４、ＩＲＦ４突变质粒分别与海参荧光素质粒和ｍｉＲ－３０ａｍｉｍｉｃｓ／ＮＣ加入到５０ｕｌ的ｏｐｔｉ．ＭＥＭ并混匀４）将２和３中质粒混匀，室温放置２０ｍｉｎ，再加入到２４孔板中的２９３Ｔ细胞中５）６．８小时后，将培液换成１０％ＦＢＳ全培液６）转染２４．３６小时，吸掉培养液，ＰＢＳ洗一下细胞７）每孔加入１００ｕｌＰＬＢ（ＰａｓｓｉｖｅＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ），轻轻摇晃细胞，室温放置１５ｍｉｎ，石细胞充分裂解８）将细胞裂解液加入ＥＰ管中，置于冰上，准备上机９）将２０ｕｌ荧光素酶底物与４ｕｌＰＬＢ混合，读取荧光值ｌＯ）加入２０ｕｌＳｔｏｐ＆ＧｌｏＲｅａｇｅｎｔ，再上机检测海参荧光值１１）算得两者的比值在与对照比较，得出实验结果６．ＥＡＥ造模及体内过表达ｍｉＲＮＡ－３０ａ１）制备完全弗式佐剂：将结核菌素Ｍｔｂ溶解在不完全弗式佐剂ＣＦＡ中，用陶瓷研钵边研磨边加ＣＦＡ，最后溶解浓度为４ｍｇ／ｍｌ２）ＭＯＧ３５－５５粉末溶解到无菌ＰＢＳ中，最后溶解浓度为２ｍｇ／ｍｌ·１７－