移植沉默TSG-6基因的骨髓间充质干细胞对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响

2024-07-29 作者:

第３５卷２０１４年第１期　１月　中山大学学报（医学科学版）　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＳＵＮ　ＹＡＴ—ＳＥＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＭＥＤＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥＳ）　Ｖｏｌ－３５　Ｎｏ．１　Ｊａｎ．２０１４　移植沉默ＴＳＧ一６基因的骨髓问充质干细胞对大鼠肝脏　缺血再灌注损伤的影响　刘双权　，成名翔　，龚建平　，涂兵¨　（重庆医科大学１．附属第二医院肝胆外科，重庆４０００１０；２附属第一医院肝胆外科，重庆４０００１６）　摘要：【目的】在大鼠肝脏缺血再灌注模型中，观察移植沉默ＴＳＧ一６基因的骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣ）对大鼠肝脏缺　血再灌注损伤（ＨＩＲＩ）的影响。【方法】全骨髓培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，流式细胞学鉴定，慢病毒载体（ＬＶ３一　ｓｈ１１ＳＧ一６）感染下调ＴＳＧ一６基因的表达；６０只ｓＤ雌性大鼠７０％肝脏缺血再灌注损伤模型的建立，随机分４组，ＰＢＳ组、ＢＭＳＣ　组，ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—ＢＭＳＣ组、ＴＳＧ一６一ｓｈＲＮＡ—ＢＭＳＣ组；各组大鼠分别于恢复灌注后３、６、２４　ｈ取血检测血清中ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＮＦ—　ｏｔ、ＩＬ一６含量，恢复灌注后６　ｈ取中叶肝脏组织，Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ检测ＴＳＧ一６蛋白表达，切片ＨＥ染色后光镜观察肝组织显微结　构。【结果】体外分离培养的ＢＭＳＣ状态稳定，增殖能力强，表达ＣＤ２９及ＣＤ４４，不表达ＣＤ３４及ＣＤ４５，慢病毒感染下调　ＢＭＳＣ的ＴＳＧ一６基因表达效率达７３．９９％：大鼠肝脏７０％缺血再灌注损伤模型稳定，各时间点ＴＳＧ一６一ｓｈＲＮＡ—ＢＭＳＣ组的　ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＮＦ一　、ＩＬ一６含量均高于ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—ＢＭＳＣ组（Ｐ＜０．０５）；ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—ＢＭＳＣ组的ＡＬＴ、　ＡＳＴ、ＴＮＦ—ｏｔ、ＩＬ一６含量均低于ＰＢＳ组（Ｐ＜０．０５）：ＴＳＧ一６一ｓｈＲＮＡ—ＢＭＳＣ组的肝脏ＴＳＧ一６蛋白表达低于ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ—　ＮＣ—ＢＭＳＣ组（Ｐ＜０．０５），ＰＢＳ组未见ＴＳＧ一６蛋白表达；ＴＳＧ一６一ｓｈＲＮＡ—ＢＭＳＣ组的肝组织损伤较ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—　ＢＭＳＣ组重，与ＰＢＳ组无明显区别，ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—ＢＭＳＣ组的肝组织损伤较ＰＢＳ组明显减轻。【结论】移植ＢＭＳＣ　能改善肝缺血再灌注损伤，移植沉默ＴＳＧ一６基因的骨髓间充质干细胞削弱了其对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。　关键词：骨髓间充质干细胞；肿瘤坏死因子刺激蛋白６；肝脏缺血再灌注损伤　中图分类号：Ｒ６５７．３　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７２—３５５４（２０１４）０１—００４７—０７　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ＴＳＧ－６　Ｇｅｎｅ　Ｍｏｄｉｉｅｄ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｆ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｈｅｐａｔｉｃ　Ｉｓｃｈｅｍｉａ　Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　Ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　Ｒａｔｓ　ＬＩＵ　Ｓｈｕａｎｇ—ｑｕａｎ　，ＣＨＥＮＧ　Ｍｉｎｇ—ｘｉａｎｇ　，ＧＯＮＧ　Ｊｉａｎ—ｐｉｎｇ　，ＴＵ　Ｂｉｎｇ　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４０００１０，　Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４０００１６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：　【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＴＳＧ一６　ｓｉｌｅｎｃｅｄ　ｂｏｎｅ　ｍａ￣ｏｗ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ＢＭＳＣ）ｏｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ（ＨＩＲＩ）ｏｆ　ｒａｔｓ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】ＢＭＳＣ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｂｏｎｅ　ｍａ￣ｏｗ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ　ｗｉｔｈ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｗｅ　ｄｏｗｎ・ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ＴＳＧ一６　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＢＭＳＣ　ｗｉｔｈ　ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ（ＬＶ３一　ｓｈＴＳＧ．６）．６０　ＨＩＲＩ　ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　ｆｅｍａｌｅ　ＳＤ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｉｎｔｏ　ｆｏｕｒ　ｇｒｏｕｐｓ：ＰＢＳ　ｇｒｏｕｐ，ＢＭＳＣ　ｇｒｏｕｐ，ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—ＢＭＳＣ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ＴＳＧ—ｓｈＲＮＡ．ＢＭＳＣ　ｇｒｏｕｐ．Ｓｅｒｕｍ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＡＬＴ，ＡＳＴ，ＴＮＦ—　ａｎｄ　ＩＬ－６　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　３　ｈｏｕｒｓ，６　ｈｏｕｒｓ　ａｎｄ　２４　ｈｏｕｒｓ曲ｅｌ＂　ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．６　ｈｏｕｒｓ　ａｆｔｅｒ　ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ．１ｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ＨＥ．ｔｈｅｎ　ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｌｉｇｈｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ＴＳＧ一６　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ．　【Ｒｅｓｕｌｔｓ】Ｔｈｅ　ｓｔａｔｕｓ　ｏｆ　ＢＭＳＣ　ｗｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｕｈｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｗｅｒｅ　ｓｔｅａｄｙ　ａｎｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ａｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｗｈｉｃｈ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ＣＤ２９　ａｎｄ　ＣＤ４４　ｂｕｔ　ＣＤ３４　ｏｒ　ＣＤ４５．Ｔｈｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＳＧ一６　ｉｎ　ＢＭＳＣ　ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＬＶ３一ｓｈＴＳＧ一６　ｗａｓ　７３．９９％．ＨＩＲＩ　ｆｏｒ　７０％　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌ　ｗａｓ　ｍｏｄｅｌｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｓｅｒｕｍ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＡＬＴ，ＡＳＴ，ＴＮＦ・ｄ　ａｎｄ　ＩＬ一６　ｉｎ　ＴＳＧ・６一ｓｈＲＮＡ－ＢＭＳＣ　ｇｒｏｕｐ　ａｔ　ｅｖｅｒｙ　ｔｉｍｅ　ｐｏｉｎｔ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ＢＭＳＣ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｓｈＲＮＡ－ＮＣ—ＢＭＳＣ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５），ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｓｅ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　收稿日期：２０１３—０９—０２　基金项目：重庆市科委项目（ｃｓｔｃ２０１２ｊｊＡＯ１０２）　作者简介：刘双权，硕士研究生，医师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｕａｎｇｑｕａｎ＠ｙｅａｈ．ｎｅｔ；　通信作者：涂兵，博士后，主任医师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｉｎｇ＿＿ｔｕ＠１６３．ｔｏｍ　４８　中山大学学报（医学科学版）　第３５卷　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ＢＭＳＣ　ｇｍｕＰ　ａｎｄ　ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—ＢＭＳＣ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ＰＢＳ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．ＴＳＧ一６　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎ　ＴＳＧ一６一ｓｈＲＮＡ—ＢＭＳＣ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ＢＭＳＣ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—ＢＭＳＣ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜Ｏ．０５）ａｎｄ　ｎｏ　ＴＳＧ一６　Ｄｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｉｎ　ＰＢＳ　ｇｒｏｕｐ．　Ｍｏｒｅ　ｓｅｒｉｏｕｓ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ＴＳＧ一６一ｓｈＲＮＡ—ＢＭＳＣ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ＰＢＳ　ｇｒｏｕｐ　ｗｈｅｎ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ＢＭＳＣ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｓｈＲＮＡ—Ｎｃ—ＢＭＳＣ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢＭＳＣ　ｃｏｕｌｄ　ｍｉｔｉｇａｔｅ　ＨＩＲＩ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｗｈｅｎ　ＴＳＧ一６　ｗａｓ　ｓｉｌｅｎｃｅｄ　ｂｙ　ｓｈＲＮＡ，ｔｈｉｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｌａｒｇｅｌｙ　ｉｍｐａｉｒｅｄ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ＴＮＦ—　—ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　６；ｈｅｐａｔｉｃ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ　『Ｊ　ＳＵＮ　Ｙａｔ．ｓｅｎ　Ｕｎｉｖ（Ｍｅｄ　Ｓｃｉ），２０１４，３５（１）：４７－５３］　肝脏缺血再灌注损伤（ｈｅｐａｔｉｃ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ，ＨＩＲＩ）是存在于肝胆外科临床　抗体购于美国Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ公司，慢病毒载体ＬＶ３一　ｓｈＴＳＧ一６购于中国上海吉玛公司。　工作中的一个不可避免事件，尤其肝移植是目前　被公认的作为各种终末期肝病的一种最有效的治　疗方案，缺血再灌注更是不可避免，其引发的肝脏　缺血再灌注损伤是造成移植肝脏肝功能不良或者　无功能，进而导致移植失败的一个重要原因。另　外，由于边缘性供肝对缺血再灌注损伤更加敏感，　造成可用于移植的供肝数量急剧减少［１－２］．因此探　索新的方法减轻ＨＩＲＩ对改善肝移植患者预后及　扩大供肝来源具有重要临床意义。骨髓问充质干　细胞（ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣ）　是成体多能干细胞，不仅具有自我更新、多向分化　的潜力，还能分泌多种生长因子。对损伤组织的修　复和再生具有重要作用。随着对其旁分泌机制的　深入研究，发现ＢＭＳＣ还能调节免疫应答［引，抑制　炎症反应［　。研究发现ＢＭＳＣ主要通过分泌肿瘤　坏死因子刺激蛋白６　Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ—　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　６　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＴＳＧ一６）发挥抗炎效应［　剖。　进一步研究发现门静脉移植ＢＭＳＣ具有改善大鼠　肝脏缺血再灌注损伤的作用７＿，其作用机制是否　通过分泌ＴＳＧ一６发挥效应，目前尚不清楚。本文　旨在通过门静脉移植体外沉默ＴＳＧ一６基因的　ＢＭＳＣ，探索ＢＭＳＣ分泌的ＴＳＧ一６是否具有改善　ＨＩＲＩ的作用。　１材料与方法　１．１　实验动物和主要试剂　实验动物：健康雌性ｓＤ大鼠，体质量８０—　１００　ｇ，１０只；体质量２００～２５０　ｇ，６０只；均购买于　重庆医科大学实验动物中心．实验过程中对动物　处置符合动物伦理学标准。主要试剂：ＤＭＥＭ／Ｆ１２　培养基、胎牛血清、Ｏ．２５％胰酶均购于南美Ｈｙｃｌｏｎｅ　公司，ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ３４抗体购于美国Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　公司，ＣＤ４５抗体美国加州Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ公司．ＴＳＧ一６　１．２大鼠骨髓问充质干细胞的分离培养及鉴定　取８０～１００　ｇ　ＳＤ大鼠，脱颈处死，浸泡于７５％　消毒酒精中１５　ｍｉｎ，无菌条件下取出股骨、胫骨于　３７　ｃＩＣ预热的ＰＢＳ中，剔除其表面的肌肉及筋膜，　减去两端的骨骺．用ＤＭＥＭ（低糖）培养基冲洗骨　髓至细胞培养皿中，直至变苍白，轻轻吹打骨髓冲　洗液、混匀，收集冲洗液，８００　ｒ／ｍｉｎ，ｒ＝１４　ｃｍ，离　心５　ｍｉｎ，离心后用含１００　ｍＬ／Ｌ胎牛血清、１％青　霉素／链霉素的ＤＭＥＭ（低糖）培养基重悬细胞沉　淀。接种于细胞培养皿中，置于３７℃、含体积分数　为５％ＣＯ　的细胞培养箱中培养，７２　ｈ后首次换　液。以后２　３　ｄ换液一次．９　ｄ左右细胞融合８０％　～９０％后首次传代，用０．２５％胰酶消化１～２　ｍｉｎ　后，用含血清的培养基终止，吹打１　ｍｉｎ，８００　ｒ／　ｍｉｎ，ｒ＝１４　ｃｍ离心５　ｍｉｎ，用含１００　ｍＬ／Ｌ胎牛血　清、１％青霉素／链霉素的ＤＭＥＭ（低糖）培养基重　悬细胞，制成单细胞悬液，按１：２进行传代。　收集Ｐ４代细胞，制成单细胞悬液，ＰＢＳ洗涤２　次，调整细胞浓度１０６个／ｍＬ，取其１００　ＩｘＬ样品，　分别加入ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ３４抗体，流式细　胞仪检测ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ３４抗原的表达，　本实验所有细胞均取第４～８代细胞。　１．３慢病毒转染大鼠骨髓问充质干细胞　选取生长状态良好的Ｐ４代细胞进行慢病毒　感染，感染前ｌｄ，将细胞接种于２４孔板，密度５　Ｘ　１０４个／孑Ｌ，将Ｐ４代细胞随机分为空白对照组、阴　性对照组和ＲＮＡ干扰组。ＲＮＡ干扰组，参照上海　吉玛公司载体说明书用携带针对ＴＳＧ一６基因的短　发夹ＲＮＡ慢病毒载体ＬＶ３一ＴＳＧ一６感染骨髓间充　质干细胞下调ＴＳＧ一６基因的表达：阴性对照组，用　携带无义基因序列的慢病毒载体ＬＶ３一ＮＣ感染骨　髓间充质干细胞；空白对照组，不加任何干预措　施。培养２４　ｈ后，在细胞长满底部约为５０％进行　感染，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情　第１期　刘双权，等．移植沉默ＴＳＧ一６基因的骨髓间充质干细胞对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响　４９　况。感染７　ｄ后用含有嘌呤霉素（４００　ｍＬ／Ｌ）的培　养基进行阳性细胞筛选。筛选后采用荧光定量　ＰＣＲ检测ＢＭＳＣ的ＴＳＧ一６沉默情况。　１．４　ＲＴ—ＰＣＲ检测大鼠ＢＭＳＣ的ＴＳＧ一６的沉　默效率　Ｐ４代ＢＭＳＣ感染后７　ｄ经筛选后收集ＲＮＡ　样品，逆转录成ｃＤＮＡ，采用Ｐｒｅｍｉｅｒ生物公司设计　的引物：ＴＳＧ一６上游ｃｃａｃｇｇｃｔｔｔｇｔａｇｇａａｇａｔａｃ，下游　ｇａｃｇｃａｔｃａｃｔｃａｇａａａｃｔｔｃａ：ＧＡＤＰＨ上游ａｃａｇｃａａｃａｇｇ　ｇｔｇｇｔｇｇａｃ，下游ｔｔｔｇａｇｇｇｔｇｃａｇｃｇａａｃｔｔ；荧光定量ＰＣＲ　检测大鼠ＢＭＳＣ的ＴＳＧ一６基因的沉默效率，各组　均重复３次。结果采用２－ａ￣ｃｒ法计算原始ＣＴ值数　据。空白对照组数据归一化处理，以其他组数据与　空白对照组的比值为纵坐标作柱状图。　１．５建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤动物模型及　实验分组　手术准备：２２０～２５０　ｇ　ＳＤ雌性大鼠６０只，禁　食１２　ｈ，自由饮水。　手术方法：将大鼠用３．５％水合氯醛（１　ｍＬ／０．１　ｋｇ）腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于手术板上。手　术区域常规备皮、消毒后，取上腹部正中切口，沿　腹白线进腹，上至剑突，下至肝脏下缘，游离肝脏　相关韧带，充分暴露肝脏及各叶相应的供血血管。　用无损伤血管夹夹闭中肝叶及左肝叶相应的供血　血管，造成７０％肝缺血，夹闭的肝叶颜色出现明显　变化，呈缺血状，用无菌浸湿生理盐水的纱布遮盖　切口。夹闭１　ｈ后移除血管夹恢复供血。随机分为　４组，恢复灌注时从门静脉注射０．５　ｍＬ　ＰＢＳ即　ＰＢＳ组，注射含２×１０　ＢＭＳＣ的Ｏ．５　ｍＬ　ＰＢＳ即　ＢＭＳＣ组。注射含２×１０　转染阴性对照的ＢＭＳＣ　的０．５　ｍＬ　ＰＢＳ即ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—ＢＭＳＣ组，注射含２　Ｘ　１０６转染ＴＳＧ一６ｓｈＲＮＡ的ＢＭＳＣ的０．５　ｍＬ　ＰＢＳ　即ＴＳＧ一６一ｓｈＲＮＡ—ＢＭＳＣ组，注射时间超过１　ｍｉｎ。　注射完后棉签压迫５　ａｒｉｎ止血，逐层缝合关腹，分　别于灌注后３、６、２４　ｈ处死动物，腹主动脉取血、　取中叶肝脏组织检测相应指标。　１．６血清ＩＲＩ程度、ＴＮＦ一　、ＩＬ一６含量检测　使用全自动生化分析仪检测ＡＬＴ、ＡＳＴ含量；　根据ＥＬＩＳＡ试剂盒说明，测定各组细胞上清液中　ＴＮＦ一　、ＩＬ一６的含量。　１．７总蛋白提取和Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ分析　再灌注６ｈ后，中叶肝脏组织总蛋白的提取和　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ按照试剂盒操作说明，采用美国Ｂｉｏ—　Ｒａｄ公司Ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｏｎｅ　４．０图像分析软件行扫描分析。　１．８　ＨＥ染色观察肝脏组织病理变化　取大鼠肝中叶组织作为肝脏标本．大小约１．０　ｃｍＸ　０．５　ｅｍＸ　０．５　ｃｍ，４０　ｇ／Ｌ多聚甲醛固定２４　ｈ后　送重庆医科大学组织病理教研室制作ＨＥ切片．　光镜下观察肝细胞损伤程度。　１．９统计学分析　所得数据以　±ｓ表示，应用ＳＰＳＳ　１８．０统计　软件分析系统，满足方差齐性时，组间比较用单因　素方差分析和独立样本的ｔ检验：不满足方差齐　性时，组间比较用秩和检验，Ｐ＜０．０５为差异有统　计学意义。　２　结　果　２．１　大鼠ＢＭＳＣ的分离培养及生物学鉴定　刚接种的细胞呈球形悬浮于培养液中，７２　ｈ　首次换液后．可见大量细胞贴壁，部分呈梭形或多　角形；５～６　ｄ可见绝大部分细胞呈短梭形，形态较　均一，部分旋涡状生长，其混有部分杂质细胞；８～　９　ｄ细胞可达８０％～９０％融合。首次传代。　Ｐ４代细胞经流式细胞仪鉴定，具有ＢＭＳＣ特　征的表面抗原ＣＤ２９和ＣＤ４４的阳性率分别为　９９．９７％、９９．９５％，而ＣＤ４５和ＣＤ３４的阳性率分别　为２．４９％、３．８７％（图１）。　２．２慢病毒成功转染大鼠ＢＭＳＣ　大鼠ＢＭＳＣ感染慢病毒４８　ｈ后可见较弱的荧　光表达，此后荧光逐渐加强，５—７　ｄ趋于稳定，感　染第７天，加嘌呤霉素筛选，采用荧光定量ＰＣＲ　检测ＴＳＧ一６的ｍＲＮＡ表达。检测发现ＴＳＧ一６的沉　默效率为：７３．９９％，与空白对照组和阴性对照组的　差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），空白对照组与阴性　对照组无统计学差异（Ｐ＞０．０５，图２、３）。　２．３大鼠肝功能检测结果　２．３．１　血清ＡＬＴ、ＡＳＴ　ＡＬＴ、ＡＳＴ于术后６　ｈ达峰　值，随后逐渐下降，待２４　ｈ仍处于一个较高数值，　实验中明显可见ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—ＢＭＳＣ组　在各相应时间点的数值明显低于ＰＢＳ组，ＴＳＧ一６一　ｓｈＲＮＡ—ＢＭＳＣ组的数值明显高于ＢＭＳＣ组和　ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—ＢＭＳＣ组，差异均具有统计学意义（Ｐ　＜０．０５；表ｌ、２）。　２．３．２　血清ＴＮＦ一０【和ＩＬ一６　ＴＮＦ一　、ＩＬ一６于术后　６　ｈ达峰值。随后逐渐下降，待２４　ｈ仍处于一个较　１Ｊ　１Ｊ第１期　刘双权，等．移植沉默ＴＳＧ一６基因的骨髓间充质干细胞对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响　５３　ｓｈＲＮＡ—ＢＭＳＣ组的ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＮＦ—　、ＩＬ一６的含　量高于ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—ＢＭＳＣ组．ＴＳＧ一６一　ｓｈＲＮＡ—ＢＭＳＣ组与ＰＢＳ组无明显区别：ＴＳＧ一６一　ｓｈＲＮＡ—ＢＭＳＣ组的ＴＳＧ一６蛋白表达明显低于　ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—ＢＭＳＣ组。在ＰＢＳ组未见　ＴＳＧ一６蛋白表达；光镜下观察肝脏组织显微结构　发现，ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—ＢＭＳＣ组的肝脏损　伤情况较ＰＢＳ组明显减轻．ＴＳＧ一６一ｓｈＲＮＡ—ＢＭＳＣ　组与ＢＭＳＣ组和ｓｈＲＮＡ—ＮＣ—ＢＭＳＣ组相比．肝脏　损伤情况明显加重。与ＰＢＳ组无明显区别。可见经　门静脉移植ＢＭＳＣ具有保护肝脏缺血再灌注损伤　作用，当下调ＢＭＳＣ的ＴＳＧ一６基因表达后发现，其　保护肝脏缺血再灌注损伤的作用减弱。本研究主　要以ＢＭＳＣ为处理因素。实验研究对象最长为２４　小时，再加上肝脏主要由肝细胞组成，在本研究中　估计ＴＳＧ一６的分泌表达与脂肪细胞的分化与成熟　关系不大。由此我们认为ＢＭＳＣ分泌表达的ＴＳＧ一　６在一定程度上具有保护缺血再灌注损伤的作用，　或者说ＢＭＳＣ发挥保护肝脏缺血再灌注损伤的作　用和其分泌表达的ＴＳＧ一６相关。当然ＢＭＳＣ是否　还通过其他机制与保护肝脏缺血再灌注损伤有关　以及其通过分泌表达ＴＳＧ一６起作用的具体机制，　还需后续进一步的相关研究。　参考文献　Ｚａｏｕａｌｉ　ＭＡ．Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｐｒｏｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｓｔｅａｔｏｔｉｃ　ａｎｄ　ｎｏｎ－ｓｔｅａｔｏｔｉｃ　ｌｉｖｅｒ　ｇｒａｆｔ　ａｇａｉｎｓｔ　ｃｏｌｄ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｅｘｐ　Ｍｏｌ　Ｐａｔｈｏｌ，２０１３，９４（２）：　３５２—３５９．　Ｅａｓｏｎ　ＪＤ，　Ｒｏｗｅｌｌ　ＤＬ．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｏｃｈｓｎｅｒ　Ｊ，１９９９，１（１）：２７－３２．　Ｐｏｐｐ　ＦＣ．ＭｅｓｅｎｃｈｙｍＭ　ｓｔｅｍ　ｃｅＨｓ　ａｓ　ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ　ａｆｔｅｒ　ｌｉｖｅｒ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｌｉｖｅｒ　Ｔｒａｎｓｐｌ，２００９，１５　（１０）：１１９２—１１９８．　Ｐｒｏｃｋｏｐ　ＤＪ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ／ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ（ＢＭＳＣｓ）：　ｒｏｌｅ　ａｓ　ｇｕａｒｄｉａｎｓ　ｏｆ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ，２０１２．　２０（１）：１４－２０．　Ｗａｎｇ　Ｎ．ＭｅｓｅｎｃｈｙｍＭ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｔｔｅｎｕａｔｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｅＭ　ｉｎｊｕｒｙ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆＴＳＧ－６［Ｊ］．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，２０１２，　７（８）：ｅ４３７６８．　Ｐｒｏｃｋｏｐ　ＤＪ．Ｔｗｏ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｆｏｅｄｂａｃｋ　ｌｏｏｐｓ　ｐｌａｃｅ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ／ｓｔｍｍａｌ　ｃｅｌｌｓ（ＢＭＳＣｓ）ａｔ　ｔｈｅ　ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　ｅａｒｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ　ｏｆ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ［Ｊ１．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，　２０１３，１１（９）：３４５—３６７．　Ｋａｎａｚａｗａ　Ｈ．Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ａ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，２０１１，６（４）：ｅ１９１９５．　［８］Ａｂｕ－Ａｍａｒａ　Ｍ．Ｌｉｖｅｒ　ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ：　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｉｎ　ｉｌｆｎａｍｍａｔｏｒｙ　ｎｅｔｗｏｒｋｓ：ａ　ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｌｉｖｅｒ　Ｔｒａｎｓｐｌ，２０１０，１６（９）：ｐ１０１６－１０３２．　［９］Ｂｈｏｇａｌ　ＲＨ．　Ｓｕｔａｒｉａ　Ｒ，　Ａｆｆｏｒｄ　ＳＣ．Ｈｅｐａｔｉｃ　ｌｉｖｅｒ　ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｆｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ：ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｉｎ　ｉｌｆｎａｍｍａｔｏｒｙ　ｎｅｔｗｏｒｋｓ：ａ　ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｌｉｖｅｒ　Ｔｒａｎｓｐｌ，２０１１，１７（１）：Ｐ．　９５；ａｕｔｈｏｒ　ｒｅｐｌｙ　９６．　［１０］Ｔａｐｕｒｉａ　Ｎ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｏｒｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌａｔｅ　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｉｓｃｈａｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ　ｂｙ　ｒｅｍｏｔｅ　ｉｓｃｈａｅｍｉｃ　ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ［Ｊ］．ＨＰＢ（Ｏｘｆｏｒｄ），　２０１２，１４（２）：８７－９７．　［１　１］Ｌｅｅ　ＴＨ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｉｇｈｔ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｉｆｂｒｏｂｌａｓｔｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，１９９０，１０（５）：１９８２—　１９８８．　［１２］Ｍｉｌｎｅｒ　ＣＭ，Ｄａｙ　ＡＪ．ＴＳＧ－６：ａ　ｍｕｈｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　山ｉｌｆｎａｍｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ，２００３，１１６　（Ｐｔ　１０）：１８６３－１８７３．　［１３］Ｇｕｏ　ＸＲ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＳＧ－６　ｇｅｎｅ　ｄｕｒｉｎｇ　３３＂３－Ｌ１　ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｉｖｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ—ａｌｐｈａ［Ｊ］．ＺｈｏｎｇｈＨａ　Ｅｒ　Ｋｅ　Ｚａ　Ｚｈｉ，　２００４，４２（５）：３４４—３４７．　［１４］Ｋｖｅｚｅｒｅｌｉ　Ｍ．ＴＳＧ－６　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｉｓｌｅｔｓ　ｏｆ　ＮＯＤ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｈｉｓｔｏｌ，２００８，３９（６）：５８５—　５９３．　［１５］Ｒｏｄｄｙ　ＧＷ．　Ａｃｔｉｏｎ　ａｔ　ａ　ｄｉｓｔａｎｃｅ：　ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ　ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ　ａｄｕｈ　ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｎｓ　（ＢＭＳＣｓ）　ｒｅｄｕｃｅ　ｉｌｆｎａｍｍａｔｏｒｙ　ｄａｍａｇｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｒｎｅａ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｐｒｉｍａｒｉｌｙ　ｂｙ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＮＦ－Ｍｐｈａ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ／ｐｒｏｔｅｉｎ　６［Ｊ］．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，２０１１，２９　（１０）：１５７２—１５７９．　［１６］Ｗａｎｎｅｍｕｅｈｌｅｒ　ＴＪ．Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ＭｅｓｅｎｅｈｙｍＭ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｎ　Ｓｅｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｓｕｒｇ　Ｒｅｓ，２０１２，１７３（１）：　１　１３—１２６．　［１７］Ｗａｎｇ　Ｎ．Ｎｏｖｅｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｆｏｒ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ：ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｕｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　Ｍｐｈａ—　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｇｅｎｅ一６［Ｊ］．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ　Ｔｈｅｒ，２０１２，３　（６）：５１－５９．　［１８］Ｃｈｏｉ　Ｈ．Ａｎｔｉ—ｉｌｆｎａｍｍａｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＴＳＧ一６　ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｂｙ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＢＭＳＣｓ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ　ｚｙｍｏｓａｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｏｕｓｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ　ｂｙ　ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ　Ｉ　Ｒ２／ＮＦ—ｋａｐｐａＢ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｒｅｓｉｄｅｎｔ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２０１１，１１８（２）：３３０－　３３８．　（编辑徐杰）