55例bactectmmgit960培养管内抗酸杆菌浑浊生长病例分析及其相关临床分

2024-07-29 作者:

２们４科学研究与结核病防治高峰论坛５５伪ＢＡＣＴＥＣＴＭＭＧ０培养管内抗酸杆菌浑浊生长病侧分析及相关临床分析ＩＴ９６西安市结核病胸部肿瘤医院检验科杨翰【摘要】目的通过对５５例培养管内浑浊生长抗酸杆菌的分析，了解其特性，得到相关信息帮助临床诊断及治疗。方法通过传统染色、鉴别培养、菌种鉴定、抗结核药敏实验、ＰＣＲ、荧光杂交等方法对这５５例病例进行分析。结果得出其中５４例有ＮＴＭ生长，并找出存在与ＭＴＢ混合感染的病例。结论可初步判定浑浊生长的培养管内，约９８．２％存在ＮＴＭ的生长。在排除管内ＮＴＭ生长后，才能判断ＭＴＢ单独感染。ＮＴＭ、ＭＴＢ混合感染的及时发王嵬能帮助临床对病情做出正确的诊断，病人病情得到控制及临床治愈。关键词：ＮＴＭＮＴＭ与ＭＴＢ混合感染菌种鉴定Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｉｍ．Ｔｈｒｏｕｇｈａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅ３ｌｃａｌｌｃａｓｅｓｏｆａｃｉｄ－ｆａｓｔｂａｃｉｌｌｉｗｈｉｃｈｇｒｏｗｎｍｕｒｋｉｌｙｉｎｃｕｌｔｕｒｅｔｕｂｅｓ，ｔｈｅｆｅａｔｕｒｅｓｏｆａｃｉｄ－ｆａｓｔｂａｃｉｌｌｉｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｂｅｌｅａｒｎｔ．ａｎｄｔｈｅｒｅｌｅｖａｎｔｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｃａｎｂｅｇｏｔｔｏｈｅｌ０ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｏａｎａｌｙｓｉｓｔｈｅ３ｌｃａｓｅｓｗｉｔｈｍｅｔｈｏｄｓｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｄｙｅｉｎｇ．ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ＰＣＲａｎｄｃｕｌｔｕｒｅ，ｉｄｅｎｔｉ丘ｃａｔｉｏｎｏｆｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ａｎｔｉ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＧａｌｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｎ耵垤ｇｒｏｗｓｉｎ３０ｃａｓｅｓ．ｔｈｅｃａｓｅｏｆｍｉｘｅｄｍｕｌｔｉｐｌｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈＭＴＢｉｓｆｏｕｎｄｏｕｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｉｔｏｕｔｂｅｉｎｉｔｉａｌｌｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ也ａｔｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＮ１限压ｇｒｏｗｔｈｉｓａｂｏｕｔ９６．７％．ＯｎｌｙａｆｔｅｒｒｕｌｉｎｇｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＮＴＭ，ｓｅｐａｒａｔｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＭＴＮｃａｎｂｅｊｕｄｇｅｄ．ＴｉｍｅｌｙＳＯｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｉｘｅｄｍｕｌｔｉｐｌｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＮ硼ＭａｎｄｐａｔｉｅｎｔＭＴＢｃａｎｈｅｌｐｔＯｍａｋｅｔｈｅｒｉｇｈｔｄｉａｇｎｏｓｉｓｔｈａｔｔｈｅＣａｎｂｅｉｎｒｅｍｉｓｓｉｏｎａｎｄｇｅｔｃｌｉｎｉｃａｌｃｕｒｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄ：ｍｉｘｅｄｍｕｌｔｉｐｌｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＣｕｌｔｕｒｅＢＡＣＴＥＣＴＭＭＧＩＴ９６０系统ＢＤ公司是目前应用最广泛的以液体培养基为基础的全自动分枝杆菌检测仪器在使用ＢＡＣＴＥＣＴＭＭＧＩＴ９６０系统进行分枝杆菌培养时偶尔会出现培养管内抗酸杆菌浑浊生长的情况。为了对上述现象进行深入了解并分析成因，本研究收集了一定数量的符合上述情况的ＭＧＩＴ培养管并开展了相关研究，并研究相关病例，为临床提供可靠信息，帮助诊断治疗，减少漏诊、误诊的几率。１材料：西安市结核病胸部肿瘤医院２０１２年１１月至２０１４年０４月进行分枝杆菌培养的标本共１４６１７份，其中３３０２份标本经ＢＡＣＴＥＣＴＭＭＧＩＴ９６０系统培养报告结果为阳性，收集到培养管浑浊生长且萋一尼氏抗酸染色阳性标本５５例。２方法：２．１对生长管内的有形成分进行深度分析，包括细菌生长情况，菌种、菌型鉴定等。２．１．１萋一尼氏抗酸染色：利用抗酸杆菌中分枝菌酸与石炭酸复红形成牢固结合成复合物，且不易被盐酸酒精脱色的特点，鉴定是否为抗酸杆菌及观察细菌形态【ｌＪ。２．１．２免疫胶体金法检测：结核分枝杆菌抗原检测试剂盒（商品名：凯必利，杭州创新生物检控技术有限公司产品）是根据免疫层析法原理检测结核培养中分枝杆菌分泌到菌体外的ＭＰＢ６４蛋白，用于结核与非结核分枝杆菌的鉴定。取１００Ｂｌ液体培养基菌悬液加入到试剂检测孔中，１５ｍｉＩｌ后观察，１ｈ内判定结果，检测线和质控线均出现紫红色条带为阳性，质控线出现检测线但未出现紫·８４·２们４科学研究与结核病防治高峰论坛红色条带者为阴性，质控线未出者表示试剂存在问题而必须重新检测。２．１．３ＰＣＲ一荧光探针法：分支杆菌核酸检测试剂盒（商品名：晶芯，博奥生物有限公司产品）采用双重ＰＣＲ技术和Ｔａｑｍａｎ探针技术相结合，对临床标本中提取的分支杆菌核酸进行定性检测。分别针对结核分枝杆菌复合群和分支杆菌特异性序列设计引物和探针，两个探针标记不同荧光基团，监测不同荧光通道的荧光信号变化，实现结核分枝杆菌复合群和非结核分支杆菌的检测。检测结果的解释，见表１：表１ＰＣＲ－荧光探针法结果解释注：针通道ＦＡＭ通道为结核分枝杆菌复合群特异性序列荧光标记探针通道，脏Ｘ通道分支杆菌特异性序列荧光标记探２．１．４ＮＴＭ的菌型鉴定采用ＤＮＡ微阵列芯片法：结核分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（商品名：晶芯，博奥生物有限公司产品１对临床常见分枝杆菌设计特异性的ＰＣＲ扩增弓ｌ物及种属特异性寡核苷酸探针。以临床样品中分离的致病菌ＤＮＡ为模板，运用独特的不对称ＰＣＲ技术进行扩增反应。由于引物末端标记有荧光，因此在扩增过程中待测的ＤＮＡ分子被扩增为带有荧光分子的片段。荧光标记片段与芯片上的探针在一定条件下根据碱基互补配对原则进行杂交，形成稳定的二级结构，推断细菌相关信息，鉴定被测细菌的种类。２．２回顾分析５４例ＮＴＭ病例的相关标本结核分枝杆菌的ＰＣＲ－荧光探针法结果，检测是否存在结核分支杆菌感染。并对存在结核分支杆菌感染病例进行耐药基因检测２．２．１２．２．２ＰＣＲ－荧光探针法：同２．１．３方法介绍ＤＮＡ微阵列芯片法：结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（商品名：晶芯，博奥生物有限公司产品）是根据临床常见的结核分枝杆菌耐药基因ｒｐｏＢＫａｔ６及ｉｎｈＡ的特异性保守核酸序列，运用独特的不对称ＰＣＲ技术进行扩增反应，将耐药基因目的片段扩增并标记荧光分子，通过与芯片上的探针杂交，根据碱基互补配对原则，ＰＣＲ产物与探针形成稳定二级结构，从而推断出是否存在相关耐药基因的存在。３结果：３．１对生长管内的有形成分进行深度分析，包括细菌生长情况，菌种、菌型鉴定等实验结果：３．１．１对９６０培养管内菌液进行萋一尼氏抗酸染色，观察到抗酸菌形态，见图１２Ｎａ鉴别培养，免疫胶体金法检测，ＰＣＲ－荧光探针法进行菌液成分的分析，见表２【２】【７】。图１．９６０管内浑浊生长抗酸菌形态ａ．逗点状（１０×１００）ｂ．长杆样８５２０１４科学研究与结核病防治高峰论坛表２：菌液成分分析表３．１．２对２号标本分离出的ＮＴＭ与３—５５号分离出的ＮＴＭ。共５４例ＮＴＭ进行菌种签定坼¨…，见表３表３：菌种鉴定结果表菌种病例数ＭＡＣ（鸟，胞分枝杆菌复合群）３４例堪萨分枝杆菌２例龟．脓肿分枝杆菌１７例土分支杆菌１例３．２回顾分析２—５５号共５４例ＮＴＭ病例的相关标本的结核分枝杆菌ＰＣＲ结果与耐药基因检测，是否存在结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌混合感染，见表４。表４相关标本ＴＢ－ＰＣＲ，耐药基因结果表４讨论在这５５例浑浊生长的培养管内，ＮＴＭ生艮的有５４例，占到９８．２％，其中鸟．胞分枝杆菌复合群３４例，堪萨斯分枝杆菌２例，龟．脓肿分枝杆菌复合群１７例，土分支杆菌１例，多以快生长分枝杆菌为主。其原因可能是索状冈子在ＮＴＭ含奄较少或不含。以９６０培养管浑浊生长为初步筛查ＮＴＭ的准确率可达到了９８．２％。当９６０培养管浑浊生长时，我们应该考虑ＮＴＭ的存在，在排除ＮＴＭ生长后，才可报告单独的ＭＴＢ感染。１号标本经ＰＮＢ与ＰＣＲ鉴定，可能为结核分枝杆菌，将菌液进行传代培养，发现抗酸杆菌恢复了索状生长，并分泌ＭＰＢ６４蛋白。（具体原因尚待分析，考虑该标本浑浊生长的原因可能为细胞壁成分的缺失，Ｌ型变异，导致索状因子的减少）２号标本经分析，菌液中存在分泌ＭＰＢ６４蛋白的抗酸杆菌，且结核分枝杆菌特异性基因序列有拷贝，证明存在结核分枝杆菌。而ＰＮＢ鉴别培养基上分离出的菌落，不分泌ＭＰＢ６４蛋白，ＰＣＲ为结核分枝杆菌阴性，非结核分枝杆菌阳性，经鉴别为非结核分枝杆菌，因此考虑２号生长管内存在结核分枝杆菌与非结核分支杆菌混合生长。从２号病例中，我们延伸出一个新的问题，ＭＴＢ与ＮＴＭ混合感染。ＭＴＢ与ＮＴＭ是临床标本中可培养分离出的抗酸菌，近年来ＮＴＭ的感染发病率增加，病程初期常被误诊为结核病。因其耐药机制的不同，ＮＴＭ往往对抗结核药物呈原始耐药的状态。从此次的５４例ＮＴＭ耐药分析来看，ＮＴＭ对抗结核药物的耐药率往往高达９０％以上，仅ＭＡＣ对阿米卡星的敏感性达到了５０％，８６２们４科学研究与结核病舫治高蜂论坛相关报道及耐药机制表明ＮＴＭ对抗涝药物大多天然耐药［３】，因此实验室无法对ＮＴＭ做出鉴别诊断，可能导致临床医生将其归类为广泛耐药的结核病，大剂量的抗结核药物治疗小仅对病情无法缓解，反而加重了病人脏器的负担。因此，临床中从病原学角度，提供可靠地信息，对结核分枝杆菌病与非结核分枝杆菌病的诊断治疗，有着决定性的作用。因为ＭｒＢ、ＮＴＭ治疗方案的不同，因此实验室对混合感染的检测，可以帮助临床医生及时做出诊断，避免漏诊，避免病人病情迁延不治。以我们筛选的这５４例ＮＴＭ感染的病例中，我们回顾性的分析了，病人早期使用痰液等相关标本结核分枝杆菌特异性核酸ＰＣＲ的结果，发现５４例ＮＴＭ中有４例早结核分枝杆菌阳性，由于龟．脓肿分枝杆菌等快生长分枝杆菌生长迅速，消耗大量营养物质，导致结核分枝杆营养不良，无法繁殖。耐药基因结果均为野生型菌种，对异烟肼、利福平敏感。因此，培养结粜结合早期基因检测，可以避免混合感染的漏诊。而无法培养出的结核分枝杆菌，通过耐药基因的检测，可以提供出利福平、异烟肼两项药物的药敏结果，对抗结核治疗起到至关重要的作用。另外考虑到ＰＣＲ的假阳性问题，我们在做筛查时可以从实验前，实验中，试验后加以控制，此次４例病例的收集均进行了严格的控制，质控，以及过往三份同一病人同一时期的三份标本均为ＴＢ－ＰＣＲ阳性。综上所述，利用浑浊生长这种形态学上的差异，可以帮助ＮＴＭ的早期筛查。ＮＴＭ与ＭＴＢ的混合感染，必须各有一种确定方法证明两种细菌的存在，即传统ＭＰＢ６４蛋白同ＰＮＢ罗氏培养基，或基因层面测定ＭＴＢ与ＮＴＭ的特异性序列Ｉｌ们。建立一个可靠的病原学诊断流程，可以有效的帮助我们对其做出诊断，提供给临床可靠的信息，做出正确的诊断。参考文献【１】中国防痨协会，结核病诊断细菌学检验规程川，中国防痨杂志，１９９６，１８（２）：８０—８５．［２】罗春明，黄业伦，邹桂敏．光镜观察液体培养基中结核与非结核分枝杆菌生长形态的比较［Ｂ】．广东医学院学报，２００７，２５（２）：１９２．１９３［３】吴龙章，谭守勇，谭耀驹，杨建良，潘美玉，陈剑锋，曾少芳，刘燕文，１８１９株菲结核分枝杆菌行药物敏感性试验的结果分析，中国防痨杂志，２０１２，３４（１２），８２１—８２４［４】白广红，李耀军，焦向阳，胶体金法快速检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的研究【Ａ】。国际检验医学杂志，２０１３，３４（１０）：１２７４—１２７６［５】桂静，乇峰，李会莉，非结核分枝杆菌菌种ＩＴＳ－ＰＣＲ测序鉴定法与表型鉴定法对比观察【Ａ】，检验医学，２０１２，２７（１１）：９０８—９１２［６】李地灵，陈晋，非结核分枝杆菌的实验室鉴定方法学进展【Ａ】，国际检验医学杂志，２０１３，３４（１４）：１８４０—１８４２【７】邹盛华，戴腊梅，张丽水，ＢＡＣＴＥＣ９６０培养阳性５３０株分枝杆菌的形态学特征探讨，中国防痨杂志，２００９．３１（４）：１９５．１９８［８】ＭｏｌｉｃｏｔｔｉＰ，ＢｕａＡ，ＣａｎｎａｓＳ，ＣｕｂｅｄｄｕＭ，Ｒｕｇｇｅｒｉｓａｍｐｌｏｓ，ＮｏｗＭｉｏｒｏｂｉ０１．２０１３，３６（４），Ｐａｇｅｓ４０９—１１【９】Ｈａｓｈｅｍｉ－Ｓｈａｌｎａｋｉ气ＢｏｓｔａｎａｂａｄＳＺ，Ｈｅｉｄａ．ｒｉｃｈ只ＴｉｔｏｖＬＰ，ＫｈｏｓｒａｖｉＡＤ，ＳｈｅｉｌｄｆｉＮ，ＧｈａｌａｍｉＭ，ＮｏｊｏｕｍｉＳＡ，Ｓｐｅｃｉｅｓｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｎｏｎｔｕｂ∞ｃｕｌｏｕｓＭＰｉｄｎａｐ’ＺａｎｅｔｔｉＳ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｏｎ－ｔｕｂｏｒｏｕｌｏｕｓｍｙｅ，ｏｂａｏｔｃｒｉａｆｒｏｍｃｌｉｎｉｃａｌｍｙｏｏｂａｃｔｃａ＇ｉａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｕｓｐｏｃｔｅｄｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｐａｔｉｅｎｔｓ，ｂｙｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅｑｕｏｎｏｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ【ｌＯ】万彦彬．ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＧｅｎｏｔｉｃｓａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ２０，Ｄｏｃｇｍｂｃｒ２０１３，Ｐａｇｅｓ３１２－３２４实用预防医学，２０１０，１７（５）：８７９．８８２．用ＰＣＲ－限制性长度多态性鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌［Ｊ］．８７