哈维氏弧菌TS-628菌株胞外产物(ECP)蛋白酶活性的研究

2024-07-29 作者:

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第２９卷　第１期　海洋水产研究　Ｖｏ１．２９，ＮＯ．１　２　０　０　８　年２月　ＭＡＲＩＮＥ　ＦＩＳＨＥＲＩＥＳ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　Ｆｅｂ．，２００８　哈维氏弧茵ＴＳ一６２８菌株胞外产物（ＥＣＰ）蛋　白酶活性的研究　覃映雪　。　苏永全。　陈雅芳。　王　军。　（　集美大学水产学院，厦门３６１０２１）　（　厦门大学海洋系，亚热带海洋研究所，３６１００５）　摘要　采用复性电泳技术，研究环境ＰＨ、温度及培养时间对哈维氏孤菌ＴＳ一６２８菌株胞外产物　（ＥＣＰ）蛋白酶活性的影响。结果表明，胞外产物蛋白酶最适反应ｐＨ在８．５左右，酸对ＥＣＰ蛋白酶　活性的抑制明显强于碱对它的抑制作用；最适反应温度在２０～５０℃之间，２０℃以下或５０℃以上蛋　白酶活性则受到明显抑制，表明蛋白酶不仅对高温敏感，对低温也很敏感；培养１２　ｈ的胞外产物蛋白　酶活性最强。最适温度和ｐＨ条件下，主要出现３种蛋白酶，其中分子量为９４　ｋＤａ和２６　ｋＤａ的两种　蛋白显示了很强的蛋白酶活性，而且能在比较极端的温度和ｐＨ值条件下保持活性，而分子量为３５　ｋＤａ蛋白酶只在最适反应条件下出现，并且该蛋白酶的最适反应条件与弧菌病暴发时的环境条件极　为相似。由此可推测分子量９４　ｋＤａ和分子量为２６　ｋＤａ的两种蛋白可能是弧茵维持生存所必需，而　分子量为３５　ｋＤａ的蛋白酶虽然只出现在特定条件下，却可能在致病过程中起重要作用。　关键词　哈维氏孤菌　胞外产物　蛋白酶　中图分类号　Ｓ９１７．１　文献识别码　Ａ　文章编号　１０００—７０７５（２００８）０１—００８１－０５　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＥＣＰ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｖｉｂｒｉｏ　ｈａｒｖｅｙｉ　ｓｔｒａｉｎ　ＴＳ－－６２８　ＱＩＮ　Ｙｉｎｇ—ｘｕｅ　＇。　ＳＵ　Ｙｏｎｇ—ｑｕａｎ。　Ｃ　Ｈ　ＥＮ　Ｙａ—ｆａｎｇ。　ＷＡＮＧ　Ｊ　ｕｎ。　（　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｊｉｍｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ，３６１０２１）　（　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃ　Ｏｃｅａｎ，Ｘｉａｍｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，３６１００５）　ＡＢＳＴＲＡＣＴ　ＳＤＳ——ｇｅｌａｔｉｎ——ＰＡＧＥ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐ　Ｈ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ，　ａｎｄ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＥＣＰ）ｏｆ　Ｖｉｂｒｉｏ　ｈａｒ—　ｖｅｙｉ　ＴＳ－６２８　ｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｐＨ　ｆｏｒ　ＥＣＰ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　ａ—　ｂｏｕｔ　８．５　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｍｏｒｅ　ｅａｓｉｌｙ　ｂｙ　ｌｏｗｅｒ　ｖａｌｕｅｓ　ｏｆ　ｐＨ　ｔｈａｎ　ｂｙ　ｈｉｇｈ—　ｅｒ　ｏｎｅｓ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｗａｓ　２０￣５０℃，ａｎｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｅｃｒｅａｓｅ　ｉｎ　ａｃ—　ｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ａｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　ｂｅｌｏｗ　２０℃ｏｒ　ａｂｏｖｅ　５０。Ｃ，ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｗａｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ｂｏｔｈ　ｌｏｗ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ．Ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ａｆｔｅｒ　１　２　ｈ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　福建省青年科技人才创新基金项目（２ＯＯ６Ｆ３Ｏ９６）和集美大学科研基金项目共同资助　＊通讯作者。Ｅ－ｍａｉｌ；ｙｑｓｕ＠ｊｉｎｇｘｉａｎ．ｘｍｕ．ｅｄｕ．ｃｒｔ　收稿日期：２００７—０３　０３；接受日期：２００７—０６—２９　作者简介；覃映雪（１９７６一），女，博士，主要从事水产病害微生物研究。Ｅ－ｍａｉｌ：Ｙｉｎｇｘｕｅ—ｑｉｎ＠１６３．ｃｏｒｎ，Ｔｅｌ：（０５９２）６１８０２０４　维普资讯

８２　海洋水产研究　第２９卷　ａｎｄ　ｐＨ，ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｔｈｒｅｅ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ：９４ｋＤａ，２６ｋＤａ　ａｎｄ　３５ｋＤａ。Ｔｈｅ　９４ｋＤａ　ａｎｄ　２６ｋＤａ　ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ｈｉｇｈ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅｍａｉｎ　ａｃｔｉｖｅ　ｕｎｄｅｒ　ｅｘｔｒｅｍｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　ｐ　Ｈ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　３　５　ｋＤａ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｗａｓ　ｏｎｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｏｕｔｂｕｒｓｔ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｖｉｂｒｉｏ．Ｉｔ　ｉｓ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　９４ｋＤａ　ａｎｄ　２６ｋＤａ　ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｎｅｃｅｓｓａｒｙ　ｉｎ　ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｖｉｂｒｉｏ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　３５ｋＤａ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｃｏｕｌｄ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ．　ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ　Ⅵｂｒｉｏ　ｈａｒｖｅｙｉ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　胞外产物（ＥＣＰ）是致病菌在生长繁殖过程中释放出的代谢产物，是侵染机体的主要成分之一。ＥＣＰ可以　抵抗宿主免疫因子的作用，分解破坏宿主机体的组织成分，有利于其他病原的进一步侵染；还可以破坏机体血　淋巴中凝血系统的酶活性，破坏血细胞，影响其功能发挥，并导致溶血现象的发生等等，因此ＥＣＰ成为决定病　原菌毒力的重要因素之一。　ＥＣＰ的致病成分主要有蛋白酶、溶血素、肠毒素、细胞毒素等等。致病性弧菌能产生多种蛋白酶，主要有半胱　氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原蛋白酶、明胶酶等等（吴后波等２００３）。蛋白酶的活性对病原菌的　致病性具有重要作用，而且已在多种鱼、虾的病原弧菌中发现具有强烈致病作用的胞外蛋白酶。哈维氏弧菌是水　产养殖中常见的条件致病菌（Ａｕｓｔｉｎ　ｅｔａ１．　２００６），关于其胞外产物蛋白酶的研究也有零星报道（Ｆｕｋａｓａｗａ　ｅｔ　ａ１．　１９８８ａ，ｂ；Ｌｉｕ　ｅｔａ１．　１９９７；Ｌｅｅ　ｅｔａ１．　１９９５；Ｚｈａｎｇ　ｅｔａ１．　２０００），但研究结果往往因人而异，说明ＥＣＰ蛋白酶受　多种因子影响，不同来源菌株的蛋白酶生化性质各不相同，因此有必要对所分离到的哈维氏弧菌ＴＳ－６２８菌株的　ＥＰＣ蛋白酶的生物活性及影响因子进行研究，以探寻蛋白酶与病原菌致病性之间的关系。　复性电泳法也称明胶原位消化法，它是２Ｏ世纪７Ｏ年代初建立起来的一种电泳技术，该技术的特点是在丙　烯酰胺胶液中加入易为蛋白酶水解的明胶，明胶在电泳过程中不发生位移，而蛋白酶与ＳＤＳ结合发生可逆变　性，电泳完毕后用ＴｒｉｔｏｎＸ一１００等非离子去垢剂去除ＳＤＳ恢复蛋白酶活性，经过适当温育，考马斯亮兰Ｒ２５０　染色后在无蛋白酶作用的地方胶被染成兰色，而有蛋白酶作用的地方胶呈现无色透明区，透明区的位置可反映　蛋白酶的等电点和相对分子量，而透明区的大小和透光度可反映酶的活性强弱（Ｈｅｕｓｓｅｎ　ｅｔ　ａ１．　１９８０）。这种　技术已经在动植物发育和衰亡过程蛋白酶活性变化的研究中得到广泛应用（Ｊｉａｎｇ　ｅｔ　ａ１．　１９９９；Ｐａｕｌ　１９９８；　张胜新等　１９９７），但在有关细菌蛋白酶活性研究方面还鲜有报道。　本试验以养殖青石斑鱼Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ　ａｗｏａｒａ溃疡病分离的细菌性病原哈维氏弧菌ＴＳ－６２８株为对象，尝　试采用复性电泳技术，研究环境ｐＨ值、温度及培养时间对该菌胞外产物蛋白酶活性的影响，为探索弧菌的致　病机制提供理论基础，并探寻防治弧菌病的有效措施。　１材料与方法　１．１　材料　１．１．１　实验菌株　哈维氏弧菌ＴＳ－６２８菌株于２００２年由本实验室从患溃疡病的青石斑鱼分离保存（Ｑｉｎ　ｅｔ　ａ１．　２００６）。　１．１．２　主要试剂　培养基为胰大豆胨琼脂（ＴｓＡ）和胰大豆胨肉汤（ＴＳＢ）（北京陆桥医学生物技术公司），配制时ＮａＣＩ含量　加至２０％ｏ。丙稀酰胺、十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）等主要生化试剂均为ＢＢＩ公司产品，其他常规化学试剂为国产　分析纯。　１．２方法　１．２．１　胞外产物的制备　菌种接种ＴＳＢ培养基，３Ｏ℃培养２４　ｈ后离心收集菌体，无菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２）反复洗涤菌体３次，最后将　维普资讯

第ｌ期　覃映雪等：哈维氏弧菌ＴＳ－６２８菌株胞外产物（ＥＣＰ）蛋白酶活性的研究　８３　ＰＢＳ稀释的菌悬液均匀涂布于表面覆盖着灭菌玻璃纸的ＴＳＡ平板上，３０℃培养，培养１２、２４、３６、４８、６０和７２　ｈ后分别收集样品。用适量无菌ＰＢＳ悬浮玻璃纸上的细菌及其分泌物，并将其收集到１．５　ｍｌ离心管中，　２５　０００　ｇ　４℃离心６Ｏ　ｍｉｎ，收集上清液用０．２２　ｍ滤纸过滤，Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法测定蛋白含量后小量分装置一２０℃　备用。　１．２．２胞外产物的复性电泳　１．２．２．１　ｐＨ对哈维氏弧菌ＴＳ－６２８胞外产物蛋白酶活性的影响　参照有关文献（Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａ１．　２０００；Ｈｅｕｓｓｅｎ　ｅｔ　ａ１．　１９８０；　Ｊｉａｎｇ　ｅｔ　ａ１．　１９９９；Ｐａｕｌ　ｅｔ　ａ１．　１９９８）并　稍作改进。具体如下：电泳采用５　的积层胶、１０　分离胶，制备分离胶时加入０．１　的明胶作为底物。哈维氏　弧菌ＴＳ－６２８培养３６　ｈ的胞外产物样品与等体积非变性上样缓冲液混合，室温下静置１０　ｍｉｎ后上样，每个上　样孔加入４．５　ｇ样品。电泳采用Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司ｍｉｎｉ—ＰＲＯＴＥＡＮ　ＩＩ　装置，在４℃下５０Ｖ预电泳１５　ｍｉｎ后　１００　Ｖ恒压电泳２　ｈ。电泳完毕，用复性缓冲液漂洗凝胶两次，每次１５　ｍｉｎ。然后将凝胶按泳道切割成大小相　仿的胶条，置于ｐＨ分别为４、６、７、８．５和１０的反应缓冲液中，３５℃温育３　ｈ。染色液染色３０　ｍｉｎ，脱色液脱色　至透明区域清晰透亮。同样条件下制备不含明胶的聚丙稀酰胺凝胶，同时进行电泳、染色和脱色，根据蛋白质　Ｍａｒｋｅｒ的分子量计算出蛋白酶的大致分子量。　１．２．２．２温度对哈维氏弧菌ＴＳ－６２８胞外产物蛋白酶活性的影响　方法基本同１．２．２．１，但反应缓冲的ｐＨ值固定为７，反应温度分别为４、１０、２０、３０、５０、６０、８０和１００。Ｃ。　１．２．２．３　培养时问对哈维氏弧菌ＴＳ－６２８胞外产物蛋白酶活性的影响　电泳样品为经过１２、２４、３６、４８、６０和７２　ｈ培养的胞外产物，上样量都是４　ｇ，反应温度为３５℃，反应缓冲　液ＰＨ为７，其余同１．２．２．１。　２　结果　２．１　ｐＨ对哈维氏弧菌ＴＳ－６２８胞外产物蛋白酶活性　的影响　从图１可以看出：一种分子量约为９４ｋＤａ的大分　子蛋白酶的活性在ｐＨ高于或低于８．５时都有所减　弱，变化并不强烈；另一种为分子量约为３５ｋＤａ，这种　蛋白酶的活性相对较弱，而且对ｐＨ极其敏感，只出现　在ｐＨ７￣８．５的范围内，过酸或过碱则消失；还有一种　６ｋＤａ　５　ｋＤａ　分子量约为２６ｋＤａ的蛋白酶，这种蛋白酶活性很强，　尤其是在反应缓冲液为最适ｐＨ即ｐＨ一８．５时，表现　出的透明区范围最大，它对ｐＨ有一定的敏感度，在　图１　ｐＨ对病原菌胞外产物蛋白酶活性的影响　Ｆｉｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｐＨ低于或高于８．５时蛋白酶的活性都受到抑制，并　在反应ｐＨ一４时几乎完全消失。　２．２温度对哈维氏弧菌ＴＳ－６２８胞外产物蛋白酶活性的影响　由图２也可以看到哈维氏弧菌胞外产物中３种主要的蛋白酶，温度对分子量９４ｋＤａ的大分子蛋白酶的影　响较ｐＨ对它的影响明显，最适反应温度在３０￣５０。Ｃ之间，低于３０℃或高于５０℃蛋白酶活性受到抑制，而且　该酶对高温的耐受性强于对低温的耐受性，１００℃下温育３ｈ仍保持一定的活性，而在４℃下活性完全消失；分　子量为３５ｋＤａ的蛋白酶对温度也非常敏感，只出现在２０～５Ｏ℃的温度范围内；而分子量为２６ｋＤａ的蛋白酶的　最适反应温度是３０～５Ｏ℃，随着温度的升高或降低，该酶所处位置出现的透明区逐渐缩小，透明度逐渐减弱。　维普资讯

８４　海洋水产研究　第２９卷　２．３培养时间对哈维氏弧菌ＴＳ一６２８胞外产物蛋白酶活性的影响　如图３所示，培养时问长短对哈维氏弧菌蛋白酶　种类和活性的影响较为显著。大体而言，所有样品中　１２　ｈ培养的胞外产物蛋白酶活性最强，随着培养时间　增加蛋白酶活性有逐渐下降的趋势，但培养时间达　６０ｈ蛋白酶活性有所回升。　就蛋白酶的种类而言，分子量为９４ｋＤａ的大分子　蛋白酶和分子量约为２６ｋＤａ的蛋白酶为所有样品所　共有，其中９４ｋＤａ大分子蛋白酶的活性随培养时问的　增长逐渐减弱；２６ｋＤａ的蛋白酶活性则是在３６ｈ出现　明显下降，之后培养时间增加对其活性影响不太明显。　而３５ｋＤａ的蛋白酶在１２和２４ｈ样品中没有出现，在　３６ｈ中出现后随培养时间增长活性有逐渐增强的趋　Ｆｉｇ．２　图２　ｐＨ为７的条件下温度对病原菌胞外产　物蛋白酶活性的影响　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　Ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｔ　ｐＨ　７　势。在１２和２４ｈ样品中还出现两条大致分子量分别　为４１ｋＤａ和５０ｋＤａ的蛋白酶，培养１２ｈ这两种蛋白酶　培养时间：７２　６Ｏ　４８　３６　２４　１　２　ｈ　都显示很强的活性，到３６ｈ两种蛋白酶几乎全部消失。　另外，一种大分子量约为４２ｋＤａ的蛋白在６０ｈ样品中　开始出现，７２ｈ该酶活性略有升高；还有一种分子量约　为４４ｋＤａ的蛋白酶则是在７２ｈ才出现。　３　讨论　大量研究证明致病菌的蛋白酶与病原菌对宿主的　入侵、损害及致死等机制紧密相关，因此对致病菌蛋白　酶的研究已成为病害研究的热点。早期对哈维氏弧菌　胞外蛋白酶的研究发现，不同菌株纯化得到的胞外产　物蛋白酶并不相同。如从哈维氏弧菌ＦＬＡ一１１菌株纯　化得到的蛋白酶是一个四聚体，分子量为８４ｋＤａ，在ｐＨ８．０和５５℃条件下显示最大活性，在４０℃以下活性稳　定。试验证明，该蛋白酶是一种对金属螯合剂敏感的碱性蛋白酶（Ｆｕｋａｓａｗａ　ｅｔ　ａ１．　１９８８ａ）；而另一株哈维氏　弧菌ＦＬＮ一１０８则纯化得到两种对金属螯合剂敏感的碱性蛋白酶，分别为４９ｋＤａ和４６ｋＤａ的二聚体，在ｐＨ８．０　～９．０和５０℃条件下显示最大活性，在４５℃下活性稳定（Ｆｕｋａｓａｗａ　ｅｔ　ａ１．　１９８８ｂ）。Ｌｉｕ等（１９９７）纯化哈维　氏弧菌８２０５１４菌株得到的胞外产物蛋白酶则是一种半胱氨酸蛋白酶，大致分子量为３８ｋＤａ，经２４　ｈ培养的蛋　白酶产物最大活性出现在ｐＨ８．０和５０。Ｃ的条件下，与Ｆｕｋａｓａｗａ的研究结果有相似的地方。Ｓａｅｅｄ（１９９５）则　发现培养３６　ｈ的哈维氏弧菌胞外产物的蛋白酶活性和溶血活性最强，而Ｚｈａｎｇ和Ａｕｓｔｉｎ（２０００）却认为哈维氏　弧菌胞外产物的毒性与培养基及培养基中ＮａＣ１的浓度有关，对试验虹鳟Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　ｍｙｋｉｓｓ毒性最强的是　在ＮａＣ１的浓度为１　的胰大豆胨琼脂（ＴＳＡ）培养基上培养２４ｈ的胞外产物，该产物具有最强的酪蛋白酶活　性。　综合前人的研究发现，不同学者所发现的哈维氏弧菌胞外产物蛋白酶的种类及生化性质不尽相同，主要是　与弧菌的来源和生长环境密切相关。在本研究中哈维氏弧菌ＴＳ一６２８菌株的蛋白酶组成因培养时问不同而有　所变化，但最适反应ｐＨ在８．５左右，酸对ＥＣＰ蛋白酶活性的抑制明显强于碱对它的抑制作用；最适反应温度　在２０～５０。Ｃ之间，２０℃以下或５０℃以上蛋白酶活性则受到明显抑制；１２ｈ培养的胞外产物蛋白酶活性最强，　之后随着培养时间的增加蛋白酶活性有逐渐下降的趋势，但培养时间达６０ｈ蛋白酶活性有所回升。本研究的　菌株哈维氏弧菌ＴＳ一６２８源自厦门同安湾患病青石斑。同安湾地处亚热带海区，夏季特别是在持续高温炎热　维普资讯

第１期　覃映雪等：哈维氏弧菌ＴＳ－６２８菌株胞外产物（ＥＣＰ）蛋白酶活性的研究　８５　的气候下，海水的表层水温有时可达３Ｏ℃以上；同时海洋又是一个巨大的缓冲体系，它的ｐＨ值偏碱性，一般　保持在７．５～８．４之间，高温干旱的天气海水ｐＨ值略有升高，而低温或多雨的天气海水ｐＨ值则有所下降。　海区的这些水文特征与病原菌蛋白酶的最适反应条件接近，这大概也是哈维氏弧菌引发的溃疡病易在高温、干　旱的气候条件下暴发，而在大量降雨气温下降之后病害得到缓解的原因之一。另外，最适温度和ｐＨ条件下，　主要出现３种蛋白酶，其中分子量为９４ｋＤａ和２６ｋＤａ的两种蛋白酶显示了很强的活性，而且能在比较极端的　温度和ｐＨ值条件下保持活性，而分子量为３５ｋＤａ的蛋白酶只在最适反应条件下才出现，而且它的最适条件与　病害暴发时的环境条件极其相似。由此可推测分子量９４ｋＤａ和２６ｋＤａ的两种蛋白酶可能是弧菌维持生长繁　殖所必需，而分子量为３５ｋＤａ的蛋白酶虽然只出现在最适条件下，却可能在病原菌的致病性中起重要作用。　总之，通过对哈维氏弧菌ＴＳ一６２８菌株胞外产物蛋白酶活性的研究发现，在适宜环境条件下其胞外产物蛋　白酶具有很强的生物活性。另外，哈维氏弧菌胞外产物蛋白酶的种类至少３种以上，而且种类随培养时间长短　不同而有所变化，环境ｐＨ、温度和培养时间对各种蛋白酶活性都有不同程度的影响。可以推测，哈维氏弧菌　胞外产物蛋白酶在该菌的致病过程中具有重要作用，但其对鱼类的致死浓度及致病机理还有待进一步研究。　参　考　文　献　吴后波，潘金培．２００３．病原弧菌的致病机理．水生生物学报，２７（４）：４２２￣４２６　张胜新，李金亭，徐存拴．１９９７．小白鼠发育过程中小肠蛋白酶活性变化的研究．动物学报，４３（增刊）：１０２～１０６　Ａｕｓｔｉｎ，Ｂ．，ａｎｄ　Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｈ．２００６．Ｖｉｂｒｉｏ　ｈａｒｖｅｙｉ：Ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｏｆ　ｍａｒｉｎｅ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ　ａｎｄ　ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．Ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉ　ｏｌｏｇｙ，４３：１１９—１２４　Ｆｕｋａｓａｗａ，Ｓ．　Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｋａｍｉｉ，Ａ．，Ｏｈｙａｍａ，Ｙ．，ａｎｄ　Ｏｓｕｍｉ，Ｍ．１９８８ａ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｆｏｒｍ　ａ　ｌｕｍｉｎｏｕｓ　ｂａｃｔｅｒｉ—　ｕｍ，Ｖｉｂｒｉｏ　ｈａｒｖｅｙｉ　ｓｔｒａｉｎ　ＦＬＡ一１１．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．５２：４３５～４４１　Ｆｕｋａｓａｗａ，Ｓ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｍｉｙａｈｉｒｇ，Ｍ．，ａｎｄ　Ｋｕｒａｔａ，Ｍ．１９８８ｂ．Ｓｏｍｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　ｆｏｒｍ　ａ　ｌｕｍｉｎｏｕｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｖｉｂｒｉｏ　ｈａｒ　ｖｅｙｉ　ｓｔｒａｉｎ　ＦＬＮ一１０８．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．５２：３　００９～３０１４　Ｌｉｕ，Ｐ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｋ．Ｋ．，Ｔｕ，Ｃ．Ｃ，ａｎｄ　Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．１９９７．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｌｕｍｉ　ｎｏｕｓ　Ｖ／ｂｒｉｏ　ｈａｒｖｅｙｉ．Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．３５：３２～３９　Ｌｅｅ。Ｋ．Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｌ．，ａｎｄ　Ｌｉｕ，Ｐ．Ｃ．１９９５．Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ｏｆ　ｔｉｇｅｒ　ｐｒａｗｎ　Ｐｅｎａｅｕｓ　ｍｏｎｏｄｏｎ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｖｉｂｒｉｏ　ｈａｒｖｅｙｉ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ，　ａｎｄ　ａ　ｔｏｘｉｃ　ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ａｎｄ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２５（１３）：１８Ｏ～１９２　Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｈ．，ａｎｄ　Ａｕｓｔｉｎ，Ｂ．２０００．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｖｉｂｒｉｏ　ｈａｒｖｅｙｉ　ｔｏ　ｓａｌｍｏｎｉｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｉｓｈ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２３：９３～１０２　Ｈｅｕｓｓｅｎ，Ｃ．，ａｎｄ　Ｄｏｗｄｌｅ，Ｅ．Ｂ．１　９８０．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ　ｉｎ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ　ａｎｄ　ｃｏｐｏｌｙ　ｍｅｒｉｚｅｄ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：１９６～２Ｏ２　Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｌｅｒｓ，Ａ．，Ｌｏｍａｎｉｅｃ，Ｅ．，ａｎｄ　Ａｈａｒｏｎｉ，Ｎ．１９９９　Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｅｒｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎ　ｐａｒｓｌｅｙ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５Ｏ：３７７～３８２　Ｐａｕｌ，Ｓ．，ａｎｄ　Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｒ．１９９８　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｄｕｒｉｎｇ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｄａｙｌｉｌｉｅｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，１０４：４６３～４７３　Ｑｉｎ，Ｙ．Ｘ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｓｕ，Ｙ．Ｑ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｘ．，ａｎｄ　Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｚ．２００６．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｏｆ　ｕｌｃｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ　Ⅱ叫０ⅡｒⅡ．Ａｃｔａ　Ｏｃｅａｎｏｌｏｇｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ，２５（１）：１５４～１５９　Ｓａｅｅｄ，Ｍ．Ｏ．１９９５．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖｉｂｒｉｏ　ｈａｒｖｅｙｉ　ｗｉｔｈ　ｍｏｒｔａｌｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍａｒｉｎｅ　ｆｉｓｈ　ｉｎ　Ｋｕｗａｉｔ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１３６：２１～２９