EZH2 shRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌A2780细胞系的稳定表达

2024-07-29 作者:

第３９卷第５期第６３２页　２０１０年ｌＯ月　华中科技大学学报（医学版）　Ａｃｔａ　Ｍｅｄ　Ｕｎｉｖ　Ｓｃｉ　Ｔｅｃｈｎｏｌ　Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｖｏ１．３９　Ｎｏ．５　Ｐ．６３２　Ｏｃｔ．　２０１０　ＥＺＨ２　ｓｈＲＮＡ真核表达载体的构建及其在　卵巢癌Ａ２　７　８　０细胞系的稳定表达　＊　胡　沙，　于利利，　李智敏，　韩　方，　吴莉英，　黄在菊，　王泽华△　华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科，武汉４３００２２　摘要：目的采用基因工程技术，构建ＥＺＨ２　ｓｈＲＮＡ的真核表达载体，获得稳定表达干扰质粒的卵巢癌Ａ２７８０细胞　系。方法　合成特异性干扰ＥＺＨ２的ｓｈＲＮＡ片段并定向克隆插入Ｓｕｐｅｒｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｓｈＲＮＡ质粒表达载体ｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／　Ｎｅｏ，获得表达载体ｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ—ｓｈＥＺＨ２。脂质体介导重组质粒转染Ａ２７８０细胞，经Ｇ４１８加压筛选获得稳定转　染细胞株。Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＲＴ—ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测转染后细胞系ＥＺＨ２的表达。结果　测序结果证实重组载体构建成　功，稳定转染ｓｈＥＺＨ２的Ａ２７８０细胞ＥＺＨ２的ｍＲＮＡ和蛋白水平下降（９０．２０±１．６６）　和（７３．８Ｏ士５．４９）　，Ｐ＜０．０１，　差异有统计学意义。结论成功构建ＥＺＨ２　ｓｈＲＮＡ表达载体，获得ＥＺＨ２基因稳定沉默的Ａ２７８０细胞系，为进一步研　究以ＥＺＨ２为靶点的卵巢癌治疗奠定实验基础。　关键词：ＥＺＨ２；　卵巢癌；ＲＮＡ干扰；载体构建　中圈分类号：Ｒ７３７．３１　ＤＯＩ：１０．３８７０／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—０７４１．２Ｏ１０．０５．０Ｉ】　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＺＨ２　ｓｈＲＮＡ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｓｔａｂｌｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ａ２７８０　Ｃｅｌｌｓ　Ｈｕ　Ｓｈａ，Ｙｕ　Ｌｉｌｉ，Ｌｉ　Ｚｈｉｍｉｎ　ｅｔ　ａ　Ｚ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｏｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ＴｏｎｇＪｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ。　Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏＪ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００２２，Ｃｈｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒ　ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＥＺＨ２　ａｎｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｓｔａｂｌｅ　ＥＺＨ２一ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　Ａ２７８０　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｂｙ　ｇｅｎｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｓｈＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＥＺＨ２　ｇｅｎｅ　ｗｅｒｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ａｎｄ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｓｕｐｅｒｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｓｈＲＮＡ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｅ　ｗａｓ　ｎａｍｅｄ　ｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ—ｓｈＥＺＨ２．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　Ａ２７８０　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００．ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｔａｂｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｇ４　１　８．Ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＥＺＨ２　ｉｎ　ｓｔａｂｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＲＴ—ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｓｈＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＥＺＨ２　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ（９０．２０±１．６６）　ａｎｄ（７３．８Ｏ士５．４９）　ｒｅ—　ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｉｎ　ｓｈＥＺＨ２－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｖｅｃｔｏｒ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ＥＺＨ２　ｓｈＲＮＡ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｔａｂｌｙ　ＥＺＨ２－ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　Ａ２　７８０　ｃｅｌ　Ｊ】ｉｎｅ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａ—　ｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＥＺＨ２　ｉｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｏｆ　ｚｅｓｔｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ　２；　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ；　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；　ｖｅｃｔｏｒ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ＥＺＨ２（ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｏｆ　ｚｅｓｔｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ　２）是果蝇　抑制作用，为探讨ＥＺＨ２在卵巢癌中的作用机制及　以ＥＺＨ２为靶点的基因治疗提供实验基础。　１材料与方法　１．１质粒、菌株　ｚｅｓｔｅ基因增强子ＥＥ（ｚ）］的人类同源物，是ＰｃＧ基　因家族的重要成员之一。研究表明，ＥＺＨ２通过基　因沉默和染色质重铸在肿瘤发生发展中发挥重要作　用，该基因的持续激活可导致细胞异常增殖和恶性　转化，被认为是一种新的候选癌基因　。本研究采　用基因工程技术，构建靶向沉默ＥＺＨ２的ＲＮＡ干　质粒ｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ购自上海吉玛公司，Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ菌株及人上皮性卵巢癌细胞株Ａ２７８０由　本室保存。　１．２主要试剂　扰（ＲＮＡｉ）表达载体，并将其导入卵巢癌细胞建立稳　定表达的细胞系，观察该载体对细胞ＥＺＨ２的表达　国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０９０１　５８５）　胡沙，女，１９８３年生，医学博士，Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｈａｈｕｌ９８３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｉｎ　ｅｎ　小量质粒提取试剂盒购自ＴＩＡＮＧＥＮ公司，中　量去内毒素质粒抽提试剂盒购自Ｏｍｅｇａ公司，各种　限制性内切酶、Ｔ　ＤＮＡ连接酶及凝胶回收试剂盒　通讯作者，Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｅｈｕａｗａｎｇ＠１６３．ｎｅｔ　购自ＴａＫａＲａ公司，脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００　胡　沙等．ＥＺＨ２　ｓｈＲＮＡ真核表达载体的构建及其在卵巢癌Ａ２７８０细胞系的稳定表达　・６３３・　和Ｔｒｉｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，逆转录酶试剂盒、　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ购自　Ｔｏｙｏｂｏ公司。引物由上海英骏公司合成。　１．３方法　１．３．１　ＥＺＨ２　ｓｈＲＮＡ表达载体的构建　根据　ＧｅｎＢａｎｋ提供的ＥＺＨ２基因序列，使用美国Ａｍｂｉｏ　公司在线设计软件，通过基因序列比对，挑选一条长　为２１个碱基的特异性寡核苷酸序列（５　ＧＣＡＡ—　ＣＡＣＣＣＡＡＣＡＣＴＴＡＴＡＡＧ一３　），人工合成ＥＺＨ２　基因的发夹样、两端配对的ｓｈＲＮＡ寡核苷酸。正　义链：５，＿ＣＡＣＣＧＣＡＡＣＡＣＣＣＡＡＣＡＣＴＴＡＴＡＡＧ—　ＴＴＣＡＡＧＡＧＡＣＴＴＡＴＡＡＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴＧ—　ＣＴＴＴＴＴＴＧ一３　，反义链５，＿ＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧ—　ＣＡＡＣＡＣＣＣＡＡＣＡＣＴＴＡＴＡＡＧＴＣＴＣＴＴＧＡＡＣ—　ＴＴＡＴＡＡＧＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴＧＣ一３　。将这两段互　补的寡核苷酸退火（退火缓冲液：１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ—　ＨＣ１，ｉ００　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１），形成具有粘性末端的互　补双链。按小量质粒提取纯化试剂盒说明书抽提质　粒ｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ，经酶切、回收线性ｐＧＰＵ６／　ＧＦＰ／Ｎｅｏ，与退火双链ＤＮＡ经Ｔ　ＤＮＡ连接酶　１６℃过夜定向连接，ＣａＣ１　法转化感受态大肠埃希　菌ＤＨ５　，挑取阳性克隆，送上海英骏生物技术有限　公司测序。鉴定正确的阳性克隆命名为ｐＧＰＵ６／　ＧＦＰ／Ｎｅｏ—ｓｈＥＺＨ２。　１．３．２　脂质体介导的重组质粒转染Ａ２７８０细胞及　稳定细胞株的筛选　转染前２４　ｈ，将生长状态良好　的Ａ２７８０细胞按１×１Ｏ　个／：ｆＬ接种于２４孑Ｌ板，　３７℃、５　ＣＯ。恒温培养箱培养。次日待细胞７０　～８０　融合时，将重组质粒ｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ—　ｓｈＥＺＨ２转染Ａ２７８０细胞，具体操作按Ｉ　ｉｐｏ—　ｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００脂质体转染说明书进行，同时以空　质粒转染的Ａ２７８０细胞为对照。转染后２４　ｈ将细　胞按１：１Ｏ比例传代于６孔板，转染后４８　ｈ细胞内　加入终浓度为２００　ｔｌｇ／ｍＬ的Ｇ４１８进行加压筛选，２　周后在荧光显微镜下观察阳性克隆发出荧光，有限　稀释法获得稳定表达的细胞株。　１．３．３　实时定量ＰＣＲ技术检测ＥＺＨ２　ｍＲＮＡ的　表达Ｔｒｉｚｏｌ法提取各组细胞总ＲＮＡ，按Ｔｏｙｏｂｏ　逆转录试剂盒说明书将ｍＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ。　在ＡＢＩ　７３００荧光定量ＰＣＲ仪上进行ＰＣＲ反应。　ＥＺＨ２上游引物５　ＴＴＧＴＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧ—　ＴＡＡＡＡＴＣ一３　，下游引物　５，＿ＴＣＣＣＴＡＧＴＣ—　ＣＣＧＣＧＣＡＡＴＧＡＧＣ一３　。以磷酸甘油醛脱氢酶　（ＧＡＰＤＨ）为内参，上游引物５，＿ＴＧＡＡＣＧＧ—　ＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧ一３　，下游引物５，＿ＴＣＣＡＣＣＡＣ—　ＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ一３　。反应条件：９５℃６０　Ｓ；９５℃　１５　Ｓ，５６℃１５　Ｓ，７２℃４５　Ｓ，４０个循环，用２　△ｃ　法计　算ＥＺＨ２／ＧＡＰＤＨ比值。在ＰＣＲ过程中设立无模　板阴性对照，在实验结束后进行熔解曲线分析，以鉴　定产物是否单一。本实验重复３次。　１．３．４　免疫印迹法检测ＥＺＨ２蛋白的表达　ＲＩＰＡ　法提取各组细胞总蛋白，ＢｃＡ法测定蛋白浓度。５Ｏ　／ｚｇ总蛋白进行１Ｏ　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，３００　ｍＡ　２　ｈ　转至ＮＣ膜。ＮＣ膜经５　脱脂奶粉的ＴＢＳ—Ｔ溶液　室温封闭２　ｈ后，与鼠抗人抗ＥＺＨ２多克隆抗体（１　：５００，Ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎｉｎｇ）４℃孵育过夜。ＴＢＳ－Ｔ溶液洗　膜３次后，ＮＣ膜与ＨＲＰ标记羊抗鼠二抗（１：　５　０００，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ）孵育１　ｈ，ＴＢＳ－Ｔ溶液再次漂洗３　次后ＥＣＩ　化学发光观察，Ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｏｎｅ软件对各条　带进行灰度值观察。本实验重复３次。　１．４统计学处理　计量资料结果以　±Ｓ表示。采用ＳＰＳＳ　１２．０　软件对数据进行ｔ检验，以Ｐ＜０．０５为差异有统计　学意义。　２　结果　２．１　ＥＺＨ２　ｓｈＲＮＡ表达载体的测序鉴足　如图１所示，测序结果与实验设计合成的ｐＧ—　ＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ—ｓｈＥＺＨ２靶向目标序列完全一致。　结果表明，合成的双链ＤＮＡ片段已成功地插入到　ＲＮＡｉ载体中的预计位点，并且序列完全一致，表明　靶向ＥＺＨ２基因的ｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ—ｓｈＥＺＨ２载　体构建成功。　２．２重组质粒的转染及筛选　重组质粒转染Ａ２７８０细胞４８　ｈ后，荧光显微镜　下可见绿色荧光，表明重组质粒成功转染人Ａ２７８０　细胞。经Ｇ４１８加压筛选获得单克隆稳定传代细胞　株，ＧＦＰ表达率达到９０　９／６（图２）。　２．３转染后Ａ２７８０细胞的ＥＺＨ２　ｍＲＮＡ表达　Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＲＴ—ＰＣＲ检测结果显示，ｓｈＥＺＨ２转　染组细胞ＥＺＨ２的ｍＲＮＡ表达水平较空质粒转染　组下降（９０．２０±１．６６）　，Ｐ＜０．０１，差异有统计学　意义（图３Ａ）。表明本实验设计的ｓｈＲＮＡ能有效　而特异地沉默ＥＺＨ２基因，抑制其ｍＲＮＡ表达。　２．４转染后Ａ２７８０细胞的ＥＺＨ２蛋白表达　免疫印迹结果显示，ｓｈＥＺＨ２转染组细胞的　ＥＺＨ２蛋白表达水平较空质粒转染组下降（７３．８Ｏ±　５．４９）　，Ｐ＜０．０１，差异有统计学意义（图３Ｂ）。证　实本实验设计的ｓｈＲＮＡ能有效而特异地沉默　ＥＺＨ２基因，抑制其蛋白表达。　・６３４・　华中科技大学学报（医学版）　２０１０年１０月第３９卷第５期　；圆　ａ＾Ａ瓢　ＩｃＣＧＣＡＡＣＡＣＣａ　Ｃ　ＣＴ　ＡｍＧＴＴＣＡ＾戳Ｇ叠ＣＴＴＡＴ￣ＧＴａｒ　Ｇ０ａ　ａ　ＴａＣＴ　ＴＴＴ　０皤　ＣＡＣ１　ｌａ　图１　重组质粒的ＤＮＡ测序　Ｆｉｇ．１　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　３讨论　卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤。因疾病　早期无明显症状而难以发现，７５　的患者诊断时已　经为晚期。虽然手术方式和化疗方案上有所进展，　但Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌的５年生存率仍然不足２５　］。　Ａ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｌｉｇｈｔ　ｐｈａｓｅ—ｃｏｎｔｒａｓｔｅｄ　ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；Ｂ：Ｏｐ—　ｔｉｃａｌ　ｐｈａｓｅ—ｃｏｎｔｒａｓｔｅｄ　ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｆｉｅｌｄ　因此，探讨卵巢癌发生发展的新机制、寻找新的靶向　治疗药物是目前妇科医生研究的热点。　ＥＺＨ２是组蛋白Ｈ３第２７位赖氨酸特异性的　甲基化转移酶，最初发现ＥＺＨ２在染色质修饰中发　挥作用。近年来，大量文献报道ＥＺＨ２在多种恶性　图２稳定转染ＥＺＨ２　ｓｈＲＮＡ的Ａ２７８０细胞的荧光表达（×　２００）　Ｆｉｇ．２　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｓｈＥＺＨ２　ｓｔａｂｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　Ａ２７８０　ｅｅｌ１Ｓ　Ａ　《　＿　１．０　Ｂ　丕０．８　口　ＥＺＨ２　０．６　０．４　０．２　肿瘤组织和细胞中表达升高，在肿瘤发生和进展中　乳腺癌移植瘤模型的生长速度。Ｏｕｇｏｌｋｏｖ等　亦　报道，ＲＮＡ干扰下调ＥＺＨ２的表达能抑制胰腺癌　发挥重要作用。ＥＺＨ２表达升高首先在血液系统肿　瘤中被发现　］，继而研究发现，ＥＺＨ２在肾癌、前列　腺癌和乳腺癌等许多恶性肿瘤中高表达ｌ４　ｊ。２００９　年唐移忠等　通过免疫组化检测发现，ＥＺＨ２在卵　巢癌组织中的表达较正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤　组织明显升高。同时，ＥＺＨ２的表达与肿瘤的预后　相关，是评估癌症转移的指征。将正常细胞过表达　ＥＺＨ２可促进细胞增殖、克隆形成、恶性转化　ｊ。相　反，抑制ＥＺＨ２在肿瘤细胞的表达能导致细胞生长　细胞的增殖能力。Ｂｒｙａｎｔ等　］通过干扰ＲＮＡ技术　抑制ＥＺＨ２在前列腺肿瘤细胞的表达后，细胞的增　殖和侵袭能力均明显降低。因此，ＲＮＡ干扰抑制　ＥＺＨ２的表达能抑制肿瘤细胞增殖，降低其侵袭能　力，提示ＥＺＨ２可能成为肿瘤治疗的新靶点。　为了解ＥＺＨ２在卵巢癌中的作用，探讨以　ＥＺＨ２为靶点治疗卵巢癌的可能性，我们采用ＲＮＡ　干扰技术，成功获得ＥＺＨ２稳定沉默的卵巢癌细胞　株。ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）是指内源性或外源性双链　ＲＮＡ介导的能诱导细胞内同源靶基因出现表达沉　（下转第６６６页）　阻滞，肿瘤移植瘤生长缓慢［６］。　Ｇｏｎｚａｌｅｚ等　采用ＲＮＡ干扰技术沉默ＥＺＨ２　的表达能在体外抑制乳腺癌细胞的增殖，体内降低　・６６６・　华中科技大学学报（医学版）　２０１０年１Ｏ月第３９卷第５期　壁不均一性的电生理重构。肥厚心肌心外膜和心内　膜存在不均一的Ｉ　减小，造成复极时程延长和跨室　壁复极离散度的增加。　参　考　文　献　［１］　Ａｒｔｈａｍ　Ｓ　Ｍ，Ｌａｖｉｅ　Ｃ　Ｊ，Ｍｉｌａｎｉ　Ｒ　Ｖ，ｅｔ　ａ１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ｌｅｆｔ　ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ　ａｎｄ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｙｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　ｇｕｉｎｅａ—ｐｉｇ［Ｊ］．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　Ｒｅｓ，１９９８，４０（２）：３２２—　３３１．　［６］　Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ　Ｇ　Ｆ，Ｍａｒｂａｎ　Ｅ．Ｅｌｅｃｔ　ｒ（】ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ１　ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ　ｉｎ　ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ　ａｎｄ　ｈｅａｒｔ　ｆａｉｌｕｒｅ［Ｊ］．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　Ｒｅｓ，１９９９，４２　（２）：２７０—２８３．　ａｌｓ　Ｓ　Ｊ，Ｗｕ　Ｙ，Ｘｕ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｌｅｆｔ　ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｈｙ—　［７］　Ｒｉｐｅｒｔｒｏｐｈｙ　ｗｉｔｈ　ｃａｐｔｏｐｒｉｌ　ｒｅｓｔｏｒｅｓ　ｎｏｒｍａｌ　ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ａｃｔｉｏｎ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｄｕｒａｔｉｏｎ，ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ，ａｎｄ　ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌ—　ｉｔｙ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９７，　９６（４）：１３３０—１３３６．　［Ｊ］．Ｐｒｏｇ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　Ｄｉｓ，２００９，５２（２）：１　５３—１６７．　［２］　［３］　Ｈａｒｔ　Ｇ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｅｋｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ０ｇｙ　ｉｎ　ｃａｒｄｉａｃ　ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ　ａｎｄ　ｆａｉｌｕｒｅＩ　Ｊ　１．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　Ｒｅｓ，ｌ９９４，２８（７）：９３３—９４６．　Ａｎｔｚｅｌｅｖｉｔｃｈ　Ｃ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　ａｎｄ　ｃａｒｄｉａｃ　ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ：ａｎ　ｏ—　　Ｍ　Ｍ，Ｈａｒｒｉｇａｎ　Ｅ　Ｐ，Ａｎｚｉａｎｏ　Ｒ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ＱＴ　ｉｎｔｅｒ—　［８］　Ｂｅｄｎａｒｖａｌ［Ｊ］．Ｐｒｏｇ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　Ｄｉｓ，２００１，４３（５　Ｓｕｐｐｌ　１）：１－４５．　［９］　赵国安，张存泰，马业新，等．门冬氨酸钾镁对肥厚心肌室性心　律失常的抑制作用［Ｊ］．临床心血管病杂志，２００７，２３（３）：２０６—　２０９．　ｖｅｒｖｉｅｗｌ　Ｊ　１．Ｈｃａｒｔ　Ｒｈｙｔｈｍ，２００７，４（７）：９６４—９７２．　［４３　胡杰，张存泰，　军，等．培垛普利对兔肥厚心肌室性心律失常　的影响［Ｊ］．华中科技大学学报：医学版，２００８，３７（５）：６８８—　６９ｏ．　ａｔａ　Ｊ　Ｊ，Ｗａｎｇ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　Ｉ（Ｋｓ）ｃｏｒｒｅｃｔｓ　ａｂｎｏ—　［１０３　Ｘｕ　Ｘ，Ｓａｌｒｍａｌ　ｒｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔ　ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ＬＱＴ２　ａｎｄ　ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｈｙｐｅｒｔｒ０ｐｈｙ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００２，２８３（２）：６６４—　６７０．　［５］　Ｂｒｙａｎｔ　Ｓ　Ｍ，Ｗａｎ　Ｘ，Ｓｈｉｐｓｅｙ　Ａ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｇｉｏｎａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｌａｙｅｄ　ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ　ｃｕｒｒｅｎｔ（ＩＫ　ａｎｄ　ＩＫ　）ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　（２０１０—０Ｉ－２６　收稿）　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ａｃｔｉｏｎ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｄｕｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂａｓａｌ　ｌｅｆｔ　ｖｅｎｔｒｉｅｕｌａｒ　（上接第６３４页）　默或抑制的效应。ＲＮＡｉ最初作为一种生物学现象　存在于植物、动物和线虫等有机体中。而今，ＲＮＡｉ　已成为一门生物技术，因为其抑制效果确切、高特异　性、高效性等特点而广泛应用于人体基因功能的研　究。体外化学合成ｓｉＲＮＡ转染细胞后介导ＲＮＡｉ　由于抑制时间短、成本相对较贵等缺陷而限制其应　用。近年发展出的ｓｈＲＮＡ表达载体可在体内被加　工成ｓｉＲＮＡ，以执行特异基因沉默功能。与传统基　［４］　［３１　Ｅ２］　ｔｅｉｎ　ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｏｆ　ｚｅｓｔｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ　２　ｉｓ　ａｎ　ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｔｈａｔ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｔｈｅ　ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｂｅｎｉｇｎ　ｐｒｏｓｔａｔｉｃ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ［Ｊ１．Ｍｏｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。２００９，７（９）：１４５６—１４６５．　Ｑｕａｙｅ　Ｌ，Ｇａｙｔｈｅｒ　Ｓ　Ａ，Ｒａｍｕｓ　Ｓ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｏｍ—　ｍｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖａｒｉａｎｔｓ　ｉｎ　ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ　ｏｎ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　】Ｊ　１．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００８，１４（１８）：５８３３—５８３９．　Ｃａｒｄｏｓｏ　Ｃ，Ｍｉｇｎｏｎ　Ｃ，Ｈｅｔｅｔ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ＥＺＨ２　ｇｅｎｅ：　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｖｉｓｅｄ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｉｎ　７ｑ３５　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｒｅｇｉｏｎ　ｆｏｒ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ，２０００，８（３）：１７４—１８０．　Ｗａｇｅｎｅｒ　Ｎ，Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｄ，Ｂｕｌｋｅｓｃｈｅｒ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｏｆ　ｚｅｓｔｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ　２　ｇｅｎｅ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ　ｔｏ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐ—　ｏｐｔｏｓｉｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｒｅｎａｌ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｅ—　ｅｒ，２００８，１２３（７）：ｌ５４５　１５５０．　因沉默技术相比，ＲＮＡｉ表达载体具有稳定、高效和　可传递性等优势，已经广泛应用于基因的功能研　究［１０１］］。　　Ｒ　Ｊ，Ｃｒｏｓｓ　Ｎ　Ａ，Ｅａｔｏｎ　Ｃ　Ｉ　，ｅｔ　ａ１．ＥＺＨ２　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｐｒｏ—　［５］　Ｂｒｙａｎｔｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ　ｏｆ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｓ—　ｔａｔｅ，２００７，６７（５）：５４７－５５６．　本研究以ＥＺＨ２为靶基因，将编码ＥＺＨ２　ｓｈＲ—　ＮＡ的寡核苷酸链定向克隆至ｓｈＲＮＡ质粒表达载　体ｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ，在体外构建表达ＥＺＨ２　ｓｈＲ—　ＮＡ的真核表达载体。该载体转染到细胞后，在Ｕ６　启动子作用下在细胞内转录出单链ＲＮＡ，转录体自　身折叠形成特异的短发夹结构ｓｈＲＮＡ，在细胞内产　生发卡状的ｓｉＲＮＡ，进而特异性导致ＥＺＨ２　ｍＲＮＡ　降解，长期而有效地沉默了ＥＺＨ２在人卵巢癌细胞　Ａ２７８０中的表达。本研究为后续进行ＥＺＨ２在卵　［６１　Ｇｏｎｚａｌｅｚ　Ｍ　Ｅ，Ｉ　ｉ　Ｘ，Ｔｏｙ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＺＨ２　ｄｅｃｒｅａｓｅｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ—ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｉｎｖａｓｉｖｅ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｎｄ　ｒｅｑｕｉｒｅｓ　ＢＲＣＡ１［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ。２００９，２８　（６）：８４３—８５３．　［７］　唐移忠，田金华，曾定元．组蛋白甲基化转移酶ＥＺＨ２在卵巢　癌组织Ｌ｝Ｊ的表达及意义［Ｊ］．现代预防医学，２００９，３６（１０）：　１９８０—１９８２．　ｅｅｒ　Ｃ　Ｃ－，Ｃａｏ　Ｑ，Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．ＥＺＨ２　ｉｓ　ａ　ｍａｒｋｅｒ　ｏｆ　［８］　Ｋｌａｇｇｒｅｓｓｗｅ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｔｒａｎｓｉｏｒｍａ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｒｅａｓｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｅ　Ｎａｔｌ　Ａｅａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，　２００３，１００（２０）：１１６０６　１１６１１．　［９］　Ｏｕｇｏｌｋｏｖ　Ａ　Ｖ，Ｂｉｌｉｍ　Ｖ　Ｎ，Ｂｉｌｌａｄｅａｕ　Ｄ　Ｄ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐａｎ—　ｃｒｅａｔｉｃ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｈｉｓｔｏｎｅ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｏｆ　ｚｅｓｔｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　２［Ｊ］．　Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００８，１４（２１）：６７９０—６７９６．　巢癌中的机制研究及以ＥＺＨ２为靶点的卵巢癌基　因治疗研究莫定了基础。　参　考　文　献　［１１　Ｋａｒａｎｌｋｏｌａｓ　Ｂ　Ｄ，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ　Ｍ　ｌ　，Ｗｕ　Ｉ　．Ｐｏｌｙｃｏｍｂ　ｇｒｏｕｐ　ｐｒｏ　［１０］　彭涛，周峰，杨鹏，等．ＲＮＡ干扰ＡＫＴ２影响人胰腺癌细胞株　裸鼠移植瘤对吉西他滨的敏感性［Ｊ］．华中科技大学学报：医　学版，２０１０，３９（１）：９４—９７．　［１１］　石小燕，陈萍，李林均，等．人内皮抑素对卵巢癌细胞Ａ２７８ｏ　体内外生长的影响及机制［Ｊ］．华中科技大学学报：医学版，　２００９，３８（６）：８０３—８０７．　（２０１０—０１—０６　收稿）