多肽A28增强顺铂对结肠癌细胞株HCT-116的杀伤作用

2024-07-29 作者:

中国肿瘤生物治疗杂志・ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｈｅｒ．ｏｒｇ　３１８・　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｔｈｅｒ，Ｊｕｎ．２０１０，Ｖｏ１．１７，Ｎｏ．３　ＤＯＩ：１０．３８７２／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－３８５Ｘ．２０１０．０３．０１４　・基础研究・　多肽Ａ２８增强顺铂对结肠癌细胞株ＨＣＴ一１１６的杀伤作用　张　军　，谭诗云　，陈建华　，张剑　，陈彩虹　（１．武汉大学人民医院消化内科，湖北武汉４３００６０；２．武汉凯　泰新生物技术有限公司，湖北武汉４３００７４）　［摘要】　目的：探讨计算机辅助药物设计合成研发的特异性多肽Ａ２８增强顺铂对结肠癌细胞的杀伤效应。方法ｔ以结肠　癌细胞ＨＣＴ一１１６和人脐静脉内皮细胞（ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｖｅｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ，ＨＵＶＥＣ）为实验对象，设定Ａ２８浓度为２０　ｉｘｍｏＬ／Ｌ，顺铂的浓度为１０、３０及９０　ｉｘｍｏｌ／Ｌ。ＭＴＴ法检测Ａ２８联合顺铂对ＨＣＴ一１１６细胞和ＨＵＶＥＣ细胞生长的影响，流式细胞　术检测Ａ２８联合顺铂对ＨＣＴ一１　１６细胞凋亡的影响。结果：顺铂浓度依赖性地抑制ＨＣＴ一１　１６细胞的增殖，Ａ２８显著增强顺铂　对ＨＣＴ－１１６细胞增殖的抑制及致凋亡作用。Ａ２８联合１０　ｔｔｍｏｌ／Ｌ顺铂对ＨＣＴ一１１６细胞增殖的抑制率为（４３．３±０．０３）％，显著　高于单用顺铂组的（１５．６±０．１０）％（Ｐ＜０．０１）；进一步提高联合用药的顺铂浓度（３Ｏ、９０　Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ）时，对ＨＣＴ．１１６细胞增殖抑　制率与１０　ｖ．ｍｏｌ／Ｌ顺铂时没有显著差别（Ｐ＞０．０５）。Ａ２８联合１．１、３．３、１０、３Ｏ或９０　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ顺铂时，ＨＣＴ一１１６细胞的凋亡率　［（６．０±０．０７）％、（１４．５±０．０３）％、（３４．７±０．０７）％、（３７．３±０．０８）％、（４０．６±０．０２）％］高于单用顺铂组［（５．１±０．０６）％、　（８．３±０．０２）％、（１４．６±０．０８）％、（１９．８±０．０７）％、（３２．６±０．０２）％］（Ｐ＜０．０１）。１０　ｔｘｍｏｌ／Ｌ顺铂联合２０　Ｉ￣ｍｏＬ／ＬＡ２８可以　有效杀伤ＨＣＴ－１１６细胞，且对ＨＵＶＥＣ的毒性作用较小。结论：多肽Ａ２８可提高顺铂对结肠癌细胞株ＨＣＴ一１１６的杀伤效果，　减轻对正常ＨＵＶＥＣ的毒性作用。　［关键词］结肠癌；顺铂；多肽；计算机辅助药物设计　［中图分类号］　Ｒ７３５．３　５；Ｒ７３０．５　［文献标志码］　Ａ　［文章编号］　１００７．３８５Ｘ（２０１０）０３－０３１８－０４　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ａ２８　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｏｎ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ＨＣＴ．１１６　ＺＨＡＮＧ　Ｊｕｎ　，ＴＡＮ　Ｓｈｉ—ｙｕｎ　，ＣＨＥＮ　Ｊｉａｎ—ｈｕａ　，ＺＨＡＮＧ　Ｊｉａｎ　，ＣＨＥＮ　Ｃａｉ—ｈｏｎｇ　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，　Ｒｅｎｍｉｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｗｕｈａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００６０，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ；２．Ｗｕｈａｎ　ＫａｔｙＧｅｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｗｕｈａｎ　４３００７４，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ａ２８，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｂｙ　ｃｏｍｐｕｔｅｒ　ａｉｄｅｄ　ｄｒｕｇ　ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ，ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｙｔｏｔｏｘｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ＨＣＴ一１　１６　ａｎｄ　ｈｕ—　ｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｖｅｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ（ＨＵＶＥＣ）ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ａ２８　ｗａｓ　２０／￣ｍｏｌ／Ｌ　ａｎｄ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　ｅｉｓｐｌａｔｉｎ　ｗｅｒｅ　１　０．３０　ａｎｄ　９０　ｗｍｏｌ／Ｌ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ａ２８　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｉｓｐｌａｔｉｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ＨＣＴ一１　１６　ａｎｄ　ＨＵＶＥＣ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＭＴＴ；ｔｈｅｉｒ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ＨＣＴ・１　１６　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘ・　ａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＣＴ一１　１６　ｃｅｌｌｓ：Ａ２８　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｅｎ－　ｈａｎｃｅｄ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｏｎ　ＨＣＴ一１　１６　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｏｎ　ＨＣＴ－－１　１６　ｃｅｌｌｓ，ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ　ｂｅｉｎｇ（４３．３±０．０３）％，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆｔｈｅ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｓｉｎｇｌｅ　ｇｒｏｕｐ（１５．６±０．１０）％（Ｐ＜０．０１）．Ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ，ｗｈｅｎ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　（３０，９０　ｔｒｍｏｌ／Ｌ）ｗｅｒｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ＨＣＴ．１　１　６　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｎｏｔ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　１０　￣ｍｏｌ／Ｌ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＞０．０５）．Ａ２８　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（１．１，３．３，１０，３０，ｏｒ　９０￣ｍｏｌ／Ｌ）ｉｎ．　ｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｍｏｒｅ　ＨＣＴ・１　１６　ｃｅｌｌｓ　ｔｈａｎ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｓｉｎｇｌｅ　ｇｒｏｕｐ　ｄｉｄ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｓｐｌａｔｉｎ　ａｔ　１０　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　Ａ２８　ａｔ　２０／．￣ｍｏｌ／Ｌ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｋｉｌｌｅｄ　ＨＣＴ一１　１６　ｃｅｌｌｓ，ｗｈｅｒｅａｓ　ｗｉｔｈ　ｌｅｓｓ　ｔｏｘｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ＨＵＶＥＣ　ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｐｏｌｙｐｅｐ．　ｔｉｄｅ　Ａ２８　ｃａｎ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｏｎ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ＨＣＴ一１　１　６　ａｎｄ　ｄｅｃｒｅａｓｅ　ｉｔｓ　ｌｅｔｈａｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ＨＩＩＶＥＣ．　［作者简介］张军（１９８１一）男，山东省青岛市人，硕士生，主要从事消化道肿瘤治疗方面的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｊｕｎ０５３２０２７＠１２６．ｃｏｍ　［通信作者］　谭诗￣－（ＴＡＮ　Ｓｈｉ－ｙｕｎ，ｃｏ￣ｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ），Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｎｓｈｉｙｕｎ＠ｍｅｄｍａｉｌ．ｃｏｎ．ｃｎ；陈建华（ＣＨＥＮ　Ｊｉａｎ—ｈｕａ，ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ），　Ｅ・ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｊｉａｎｈｕａ＠ｋａｔｙｇｅｎｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ。　为共同通信作者　张军，等．多肽Ａ２８增强顺铂对结肠癌细胞株ＨＣＴ一１１６的杀伤作用　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ；ｃｉｓｐｌａｔｉｎ；ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ｃｏｍｐｕｔｅｒ　ａｉｄｅｄ　ｄｒｕｇ　ｄｅｓｉｇｎ　［Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｔｈｅｒ，２０１０，１７（３）：３１８－３２１］　结肠癌是临床上常见的恶性肿瘤，在世界范围　同孵育，每个浓度设３个复孔，同时设立不加药物的　内其发病率高居第３位，病死率高居前列¨ｊ。肿瘤　治疗的方法虽不断发展与更新，但是结肠癌的治疗　方法亟待进一步完善　ｊ。铂类制剂中的顺铂（ｃｉｓｐｌ—　ａｔｉｎ，ＤＤＰ）对结肠癌有明显的治疗效果，但因其毒　性作用较大使其应用受到了一定的限制　。本课　空白对照。继续培养２４　ｈ，弃孔内液体，每孑Ｌ加入　２００　ｌ　Ｍ１ＴＩ１（质量浓度为０．５　ｍｇ／ｍ１），培养４　ｈ，弃　孔内液体，加入２００　ｐ．１　ＤＭＳＯ。振荡１０　ｍｉｎ后酶标　仪测光密度（Ｄ　。），按公式计算细胞增殖抑制率。　细胞增殖抑制率（％）＝（对照组Ｄ　一实验组　题前期通过计算机辅助药物设计合成的抗肿瘤凋亡　多肽Ａ２８有增加顺铂类化疗药物抗肿瘤敏感性的　特性　。研究。。　表明，Ａ２８多肽包含一特殊Ｎ２结　构域（ＳＨ２ＳＨ３ＳＨ２结构域），该结构域能增加宫颈　癌ＨｅＬａ细胞对顺铂的敏感性。本实验以结肠癌细　胞ＨＣＴ一１１６和人脐静脉内皮细胞（ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｖｅｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ，ＨＵＶＥＣ）为研究对象，初步探　讨特异性多肽Ａ２８对顺铂抗结肠癌细胞的增强效　果　１材料与方法　１．１主要材料　结肠癌ＨＣＴ一１　１６细胞株购自中国科学院上海　细胞库，属低分化腺癌细胞系。人脐静脉内皮细胞　株ＨＵＶＥＣ购自武汉大学中国典型培养物保藏中　心。Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ—ＦＩＴＣ／ＰＩ凋亡检测试剂盒购自美国　Ｂｌｅｎｄｅｒ公司。特异性多肽Ａ２８购自武汉凯泰新生　物技术有限公司，顺铂购自美国Ｓｉｇｍａ公司。　１．２细胞培养和实验分组　ＨＣＴ．１　１６细胞、ＨＵＶＥＣ细胞在含ｌ０％小牛血　清的ＲＰＭＩ　１６４０培养基中于３７　ｃＣ、５％ＣＯ２孵箱中　孵育。实验时取对数生长期细胞。通过先期实　验　发现，Ａ２８对ＨｅＬａ细胞的ＩＣ５０为２０　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ。　本实验中Ａ２８与顺铂联合应用时选择作用浓度为　２０［￣ｍｏｌ／Ｌ。　实验分３组：顺铂（Ｉ组）、顺铂＋Ａ２８（１Ｉ组）及　ＨＵＶＥＣ对照组，Ｉ组与Ⅱ组顺铂均设定同样的终浓　度梯度（１．１、３．３、ｌ０、３０及９０　ｐｍｌｏｌ／Ｌ），对照组加入　１０　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ　Ｊｌ质铂＋２０　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ　Ａ２８、２０　ｐ，ｍｏｌ／Ｌ　Ａ２８＋　９０　ｐａｎｏｌ／Ｌ顺铂和９０　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ』颐铂。　１．３　ＭＴＴ法检测药物对细胞生长的抑制率　收集对数生长期ＨＣＴ一１１６细胞和ＨＵＶＥＣ细　胞，以２　Ｘ　１０　个／ｍｌ的密度接种细胞于９６孔培养　板，每孑Ｌ加入２００　ｔｘｌ。孵育２４　ｈ后，铺有ＨＣＴ一１１６　细胞加入预设浓度顺铂或顺铂＋Ａ２８共同孵育，铺　有ＨＵＶＥＣ细胞加入预设浓度顺铂＋Ａ２８或顺铂共　Ｄ啪）／￣，１Ｎ组Ｄ　５７（　１Ｘ　１００％。　１．４流式细胞术检测细胞凋亡率　取对数生长期的ＨＣＴ－１　１６细胞，以１　Ｘ　１０。／ｍｌ　的密度接种于６孔培养板，孵育２４　ｈ，弃培养液，加　入预设浓度的顺铂和顺铂＋Ａ２８共同孵育２４　ｈ，收　集各组培养悬浮细胞和用胰酶消化的细胞，　１　５００×ｇ离心１０　ｒａｉｎ，弃上清。预冷ＰＢＳ洗涤细胞　２次，并将细胞重悬于１９５　ｔ＊１的结合缓冲液中，加入　５　Ｉｘｌ　Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ—ＦＩＴＣ，室温、避光反应１０　ｍｉｎ，加入５　ｌ　ＰＩ混匀，室温、避光反应５　ｒａｉｎ。筛网过滤后，上　机检测细胞凋亡率。　１．５统计学处理　所有结果数值均用　４－Ｓ表示，用ＳＰＳＳ１１．０软　件进行统计分析，多个样本之间的比较采用单因素　方差分析，两组间比较采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５表示差　异有统计学意义。　２结　果　２．１　Ａ２８促进顺铂对ＨＣＴ一１　１６细胞增殖的抑制　实验结果显示，联合用药组对ＨＣＴ一１　１６细胞增　殖的抑制率随着顺铂浓度的增加而增加，浓度１．１、　３．３、１０、３０及９０　ｔｘｍｏｌ／Ｌ时其抑制率为（８．８　４－　０．０４）％、（１５．７±０．０６）％、（４３．３±０．０３）％、　（４６．４±０．０４）％及（４７．６　４－０．０２）％，其抑制率高于　单用顺铂组的抑制率［（５．８　４－０．０８）％、（１０．９　４－　０．０８）％、（１５．６±０．１０）％、（２４．４　４－０．０６）％及　（３６．０　４－０．０１）％］。值得注意的是联合用药组中　Ａ２８浓度２０￣ｍｏｌ／Ｌ与顺铂浓度为１０、３０及９Ｏ　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ联合应用时，其对ＨＣＴ—ｌｌ６细胞增殖的抑　制已进入平台状态。　２．２　Ａ２８促进顺铂对ＨＣＴ一１　１６细胞的致凋亡作用　实验结果（图１，表１）显示，联合用药组当顺铂　浓度为３．３、ｌ０、３０及９０　Ｉ．ｚｍｏｌ／Ｌ时的凋亡率高于单　用顺铂组（Ｐ＜０．Ｏ１）。联合用药组中顺铂浓度为　ｌ０、３０及９０￣ｘｍｏＬ／Ｌ的３亚组对ＨＣＴ—ｌｌ６细胞的凋　亡率间差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５，见表１）。　中国肿瘤生物治疗杂志，２０１０年６月，１７（３）　２．３　Ａ２８和顺铂单用或联用对ＨＵＶＥＣ细胞的毒　胞的作用效果，１０　ｐ￣ｍｏ］／Ｌ顺铂＋２０￣ｍｏ］／Ｌ　Ａ２８　性作用　时ＨＣＴ一１１６的抑制率已高达（４３．３±０．０３）％＞．蜀　ｏＩｌ—　《　，而　实验结果显示，顺铂１０　ｔｘｍｏｌ／Ｌ＋２０　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ　该剂量对正常ＨＵＶＥＣ的毒性抑制却很低；如将顺铂　Ａ２８、顺铂９０　ｐ．ｍｏｌ／Ｌ＋２０　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ　Ａ２８、顺铂９０　浓度增加到９０　ｐ￣＿【　Ｅ０＿ｍｏｌ【　／Ｌ时，对肿瘤细胞的抑制还在　一　１０＿【　舀一　ｐ．ｍｏｌ／Ｌ对人正常ＨＵＶＥＣ细胞增殖的抑制率分别　同一水平［抑制率为（４７．６±０．０２）％］，但对正常　为（８．７　４－０．０２）％、（４７．２±０．０５）％、（３５．２　４－　ＨＵＶＥＣ的毒性却大大增加。　０．０７）％。对照Ａ２８联合顺铂对ＨＣＴ．１１６结肠癌细　表１不同浓度顺铂和Ａ２８联合作用对ＨＣＴ－１１６细胞凋亡的影响（Ｘ±　，％）　Ｔａｂ．１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ａ２８　ｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ＨＣＴ・１１６　ｃｅｌｓｌ（￣±ｓ，％）　ＪＰ＜０．０５．　Ｐ＜０．Ｏｌ　ｗ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　Ａ　Ｂ　２　０．４％　ｌ２　２％　２　５％　　ｌ；一叠　０　誊．　　●　－０　．　●●　雹羔　）・ｌ％，　弛　曩　图１　Ａ２８联合顺铂诱导ＨＣＴ・１１６细胞凋亡　Ｆｉｇ．１　Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ａ２８　ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ＨＣＴ・１１６　ｃｅｌｌｓ　Ａ：Ｃｔｒｌ；Ｂ：３．３　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ　ＤＤＰ；Ｃ：３．３　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ　ＤＤＰ＋２０　ｐ．ｍｏｌ／Ｌ　Ａ２８　３讨论　分子动力学模拟、结合自由能预测、能量分子模拟、　结合合成等步骤＿５　合成的多肽。并证实Ａ２８能增　顺铂是一类通过与ＤＮＡ链形成链内与链间的　加宫颈癌ＨｅＬａ细胞对顺铂的敏感性　。　交叉结合，从而干扰ＤＮＡ的合成，导致细胞周期阻　本实验中，单用顺铂１．１、３．３、１０　Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ时，对　滞并诱导肿瘤细胞发生凋亡，以达到杀伤肿瘤细胞　ＨＣＴ一１１６细胞的抑制率仅为（５．８　４－０．０８）％、　的作用　ｊ。尽管顺铂治疗肿瘤效果显著，但因其有　（１０．９±０．０８）％、（１５．６±０．１０）％，ＨＣＴ・１１６细胞　严重的毒性作用，如剧烈的恶心、呕吐、骨髓抑制、肾　凋亡率仅为（５．１　４－０．０６）％、（８．７　４－０．０２）％、　脏损伤和神经毒性等　，从而限制了其临床广泛　（１４．６±０．０８）％；当顺铂增加为９０　ｉ．Ｌｍｏｌ／Ｌ时，对肿　应用。如何增强抗癌药物对肿瘤组织的特异性而减　瘤细胞抑制率增至（３６．０　４－０．Ｏ１）％，ＨＣＴ．１１６细胞　少其毒性作用是近年来研究热点。　凋亡率增至（３２．６　４－０．０２）％。显而易见，高浓度顺　计算机辅助药物设计（ｃｏｍｐｕｔｅｒ　ａｉｄｅｄ　ｄｒｕｇ　铂抗肿瘤作用显著优于低浓度顺铂，但是不良反应　ｄｅｓｉｇｎ，ＣＡＤＤ）是近年兴起的研发新药的一种崭新　明显加重。联合用药后，联合用药组对肿瘤细胞　技术＿ｌ　。此技术是基于蛋白质相互作用可快速便　ＨＣＴ－１１６增殖的抑制率及ＨＣＴ一１１６细胞凋亡率明　捷地寻找抗癌药物　。特异性抗癌多肽Ａ２８正是　显优于单用顺铂各组，提示Ａ２８可以明显增加顺铂　采用此项技术，经过蛋白质同源模建、蛋白质对接、　的敏感性。Ｍｉｃｈｏｄ等　发现ＲａｓＧＡＰ的一个特殊的　张军，等．多肽Ａ２８增强顺铂对结肠癌细胞株ＨＣＴ一１　１６的杀伤作用　・３２１・　Ｎ２结构域（即ＳＨ２ＳＨ３ＳＨ２结构域）厶匕１５描Ｊ－Ｅｌ加肿瘤细　胞对顺铂类化疗药物敏感性。Ｍｉｅｈｏｄ等¨　还发现　Ｎ２结构域是一段包含１０个氨基酸的序列，该序列　通过融合一种具有细胞膜穿透能力的多肽ＴＡＴ＿１　，　在此基础上合成的一种具有增敏作用且易穿透细胞　膜的多肽一ＴＡＴ—ＲａｓＧＡＰⅢ　，该多肽显著增强肿瘤　细胞对基因毒类化疗药物的敏感性。　本研究中使用的Ａ２８包含了该结构域的一段　氨基酸序列，Ｎ２结构域中的ＳＨ３结构域可以与　Ｇ３ＢＰ（ＧＡＰ　ＳＨ３．ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）发生特异性的结　合，从而调控细胞的生长进程。Ｇｕｉｔａｒｄ等　。。发现　Ｇ３ＢＰ在某些肿瘤细胞如结肠腺癌、乳腺癌、头颈部　肿瘤中会过度表达，特异性抗肿瘤多肽Ａ２８具有针　对肿瘤细胞特有的靶向能力。通过其作用Ｇ３ＢＰ靶　点诱导肿瘤细胞凋亡，从而与顺铂发生协同作用和　增敏作用。目前特异性多肽ＴＡＴ—ＲａｓＧＡＰⅢ　能够　增加肿瘤细胞对基因毒类化疗药物的敏感性的具体　分子机制仍在进一步研究中，Ｍｉｃｈｏｄ等　发现特异　性多肽ＴＡＴ—ＲａｓＧＡＰ　增敏作用的发挥需要Ｐ５３　来协助完成，Ｐ５３通过ＤＮＡ依赖蛋白激酶来磷酸化　ＮＨ２端以保持其对ＤＮＡ损伤的敏感性　。　本实验还发现，当顺铂仅为１０￣ｍｏＷＬ时，联合　用药组抑制率和凋亡率急剧上升，达到了（４３．３±　０．０３）％和（３４．７±０．０７）％。当继续增加顺铂浓度　至３０、９０￣ｍｏＷＬ，其对肿瘤细胞的抑制进人平台　期，但其毒性作用却大幅增加。浓度１０　ｐ．ｉｎｏｌ／Ｌ顺　铂＋２０　Ｉ，￣ｍｏＬ／ＬＡ２８对正常ＨＵＶＥＣ细胞增殖的抑制　率为（８．７±０．０２）％，远低于顺铂９０　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ和２０　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ　Ａ２８＋９０　ｉｘｍｏｌ／Ｌ　ＪＩｂ￣，￣ｆｌ对ＨＵＶＥＣ细胞增殖　的抑制率［（３５．２±０．０７）％和（４７．２±０．０５）％］　（Ｐ＜０．０１）。由此可见联合用药时，顺铂浓度达到　一定量后其抗肿瘤作用进入平台状态，此时若盲目　增加顺铂剂量其抗肿瘤作用增加并不明显，但其毒　性作用却大幅增加。本实验提示，Ａ２８可能是一种　较理想的铂类化疗药物的增敏剂，１０　ｍｏｌ／Ｌ　Ｊ１￣￣１３　与２０　ｔｘｍｏｌ／Ｌ　Ａ２８合用，可以达到最大杀伤肿瘤细　胞效果，但毒性作用较小。综上所述，Ａ２８多肽类药　物具有潜在的临床应用价值。　［参考文献］　［１］　Ｍｏｎｚｏｎ　ＦＡ，Ｏｇｉｎｏ　Ｓ，Ｈａｍｍｏｎｄ　ＭＥ，Ｈａｌｌｉｎｇ　ＫＣ，Ｂｌｏｏｍ　ＫＪ，　Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖａ　ＭＮ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｋ－Ｒａｓ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．　Ａｒｃｈ　Ｐａｔｈｏｌ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，２００９，１３３（１０）：１６００—１６０６．　［２］　Ｏ　Ｂｒｉｅｎ　ＣＡ，Ｐｏｎｅｔｔ　Ａ，Ｇａｌｌｉｎｇｅｒ　Ｓ，Ｄｉｃｋ　ＪＥ　Ａ　ｈｕｍａｎ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆ　ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ　ｔａｎｌｏｕｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４４５（７１２３）：１０６—１１０．　［３］Ｄｅｓｏｉｚｅ　Ｂ，Ｍａｄｏｕｌｅｔ　Ｃ　Ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐｌａｔｉｎｕｍ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｕｓｅｄ　ａｔ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｏｎｃｏｌ　Ｈｅｍａｔｏｌ，　２００２，４２（３）：３１７—３２５．　［４］　Ｗａｎｇ　Ｄ，Ｌｉｐｐａｒｄ　ＳＪ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　ｐｌａｔｉｎｕｍ　ａｎｔｉｃａｎｅｅｒ　ｄｒｕｇｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｅｏｖ，２００５，４（４）：３０７－３２０．　［５］　陈建华，黄毅，熊骏宇，陈彩虹．治疗或预防癌症的多肽或衍　生产品及其应用：中国，２００８１０１９７０８５．１［Ｐ］．２００８—１０．１９．　［６］Ｍｉｃｈｏｄ　Ｄ，Ｙａｎｇ　ＪＹ，Ｃｈｅｎ　Ｊ，Ｂｏｎｎｙ　Ｃ，Ｗｉｄｍａｎｎ　Ｃ．ＡＲａｓＧＡＰ－　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｃｅｌｌ　ｐｅｒｍｅａｂｌｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｐｏｔｅｎｔｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｇｅｎｏｔｏｘｉｎ—　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００４，２３　（５５）：８９７１—８９７８．　［７］　Ｍｉｃｈｏｄ　Ｄ，Ｗｉｄｍａｎｎ　Ｃ．ＤＮＡ—ｄａｍａｇｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｎｅｗ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌ　ｔｏｏｌｓ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｃｒｉｔｉ　Ｒｅｖ　Ｏｎｃｏｌ　Ｈｅｍａｔｏｌ，２００７，６３（２）：１６０－１７１．　［８］　Ｓｈａｈｚａｄ　ＭＭ，Ｌｏｐｅｚ—Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ　Ｇ，Ｓｏｏｄ　ＡＫ．Ｎｏｖｅｌ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ　ｐｌａｔｉｎｕｍ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　Ｕｐｄａｔｅｓ，　２００９，１２（６）：１４８—１５２．　［９］Ｓｃｈｉｆ　Ｄ，Ｗｅｎ　ＰＹ，ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｎｔ　ＭＪ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｄｖｅｒｓｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ａｎｄ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｔｈｅｒａｐｉｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎ—　ｃｏｌ，２００９，６（１０）：５９６Ｊｏ０３．　［１０］Ｋａｕｓｈａｌ　ＧＰ，Ｋａｕｓｈａｌ　Ｖ，Ｈｅｒｚｏｇ　Ｃ，Ｙａｎｇ　Ｃ．Ａｕｔｏｐａｈａｇｙ　ｄｅｌａｙｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｒｅｎａｌ　ｔｕｂｕｌａｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　［Ｊ］．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，２００８，４（５）：７１０－７１２．　［１１］Ｌｅｅ　Ｓ，Ｋｉｍ　Ｗ，Ｍｏｏｎ　ＳＯ，Ｓｕｎｇ　ＭＪ，Ｋｉｍ　ＤＨ，Ｋａｎｇ　ＫＰ，ｅｔ　ａ１．　Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｎａｌ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ　［Ｊ］．Ｎｅｐｈｒｏｌ　Ｄｉａｌ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００６，２１（８）：２０９６—２１０５．　［１２］Ｓｏｎｇ　ＣＭ，Ｌｉｍ　ＳＪ，Ｔｏｎｇ　ＪＣ．Ｒｅｃｅｎｔ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｃｏｍｐｕｔｅｒ—ａｉｄｅｄ　ｄｒｕｇ　ｄｅｓｉｇｎ［Ｊ］．Ｂｒｉｅｆ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ，２００９，１０（５）：５７９－５９１．　［１　３］Ｋａｐｅｔａｎｏｖｉｃ　ＩＭ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ—ａｉｄｅｄ　ｄｒｕｇ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　（ＣＡＤＤＤ）：Ｉｎｓｉｌｉｃｏ－ｃｈｅｍｉｃｏ—ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ，２００８，１７１（２）：１６５—１７６．　［１４］Ｍｉｃｈｏｄ　Ｄ，Ａｎｎｉｂａｌｄｉ　Ａ，Ｓｃｈａｅｆｅｒ　Ｓ，Ｄａｐｐｌｅｓ　Ｃ，Ｒｏｃｈａｔ　Ｂ，Ｗｉｄ—　ｍａｎｎ　Ｃ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＲａｓＧＡＰ　Ｎ２　ｇｒａｇｍｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｏｎ　ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ｎｆｉｃｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ，２００９，１０１（１１）：８２８・　８３２．　［１５］Ｃａｒｄｏｚｏ　ＡＫ，Ｂｕｃｈｉｌｌｉｅｒ　Ｖ，Ｍａｔｈｉｅｕ　Ｍ，Ｃｈｅｎ　Ｊ，Ｏｒｔｉｓ　Ｆ，Ｌａｄｒｉ￣ｒｅ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｃｅｌｌ—ｐｅｒｍｅａｂｌｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎｄｕｃｅ　ｄｏｓｅ—ａｎｄ　ｌｅｎｇｔｈ　ｄｅｐｅｎｄ・　ｅｎｔ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ，２００７，１７６８（９）：　２２２２．２２３４．　［１６］Ｇｕｉｔａｒｄ　Ｅ，Ｐａｒｋｅｒ　Ｆ，Ｍｉｌｌｏｎ　Ｒ，Ａｂｅｃａｓｓｉｓ　Ｊ，Ｔｏｅｑｕ６　Ｂ．Ｇ３ＢＰ　ｉｓ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｔｕｍｏｒｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　Ｓ　ｐｈａｓｅ　ｅｎｔｒｙ［Ｊ］．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔ，２００１，１６５（２）：２１３－２２１．　［１７］Ｍｉｃｈｏｄ　Ｄ，Ｗｉｄｍａｎｎ　Ｃ．ＴＡＴ—ＲａｓＧＡＰⅢ。２６　ｒｅｑｕｉｒｅ　Ｐ５３　ａｎｄ　ＰＵ—　ＭＡ　ｔｏ　ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｇｅｎｏｔｏｘｉｎｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，　２００７，５（５）：４９７－５０７．　［１　８］Ｃｏｒｄｅｎｏｎｓｉ　Ｍ，Ｍｏｎｔａｇｎｅｒ　Ｍ，Ａｄｏｒｕｏ　Ｍ，Ｚａｃｃｈｉｇｎａ　Ｌ，Ｍａｒｔｅｌｌｏ　Ｇ，Ｍａｍｉｄｉ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＧＦ—ｐ　ａｎｄ　Ｒａｓ／ＭＡＰＫ　ｓｉｇｎａ‘　ｌｉｎｇ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｐ５３　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３　１５　（５８１３）：８４０．８４３．　［收稿日期］２０１０—０２—１４　［修回日期］２０１０一ｏ４一ｌ７　［本文编辑］韩丹