N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)A1298C基因突变与青年缺血性脑卒中

2024-07-29 作者:

维普资讯

张力Ｎ５，Ｎ。０一亚甲基四氢叶酸还原酶（ＭＴＨＦＲ）Ａ１２９８Ｃ基因突变与青年缺血性脑卒中的相关性　・８７７・　Ｎｓ，Ｎ１０一亚甲基四氢叶酸还原酶（ＭＴＨＦＲ）Ａ１２９８Ｃ基因突变　与青年缺血性脑卒中的相关性　张力’，卜淑霞　，张健　，南光贤　（１．吉林大学中日联谊医院，吉林长春　１３００３３；２．延边第二人民医院，吉林延吉　１３３０００）　［摘要］　目的：探讨同型半胱氨酸血症、同型半胱氨酸（Ｈｅｙ）代谢关键酶Ｎ５，Ｎ，。一亚甲基四氢叶酸还原酶（ＭＴＨＦＲ）基因　突变与青年缺血性脑卒中的关系。方法：采用病例对照分析方法，以高效液相色谱法测定受试者空腹及负荷后血浆Ｈｃｙ水平，采　用聚合酶链一限制性内切酶片段长度多态性分析（ＰＣＲ—ＲＦＬＰ）和扩增阻滞突变体系法，对１００例青年缺血性脑卒中患者和１００　例对照者的ＭＴＨＦＲ基因Ａ１２９８Ｃ位点进行检测。结果：ＭＴＨＦＲ病例组和对照组基因型分布、纯合子频率和等位基因频率差异均　无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论：ＭＴＨＦＲ　Ａ１２９８Ｃ突变导致血浆Ｈｃｙ浓度明显增高。ＭＴＨＦＲ　Ａ１２９８Ｃ基因突变与青年缺血性脑　卒中发病无相关性。　［关键词］　Ｎ　，Ｎ　。一亚甲基四氢叶酸还原酶；基因突变；青年；缺血性脑卒中　中图分类号：Ｒ７４３　文献标识码：Ａ　文章编号：１００４—０４１２（２００７）０７—０８７７—０２　Ｄｅｐｅｎｄａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ａｒｔｅｒｉａｌ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ｉｎ　ｙｏｕｔｈ　ａｎｄ　Ａ１２９８　Ｃ　ｇｅｎｅ　ｍｕ－　ｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ＺＨＡＮＧＬｉ　，ＢＵ　Ｓｈｕ—ｘｉａ　，ＺＨＡＮＧｆｉａｎ。，ＮＡＮ　Ｇｕａｎｇ—ｘｉａｎ　（Ｊ．Ｃｈｉｎａ—Ｊ￣ｐａｎ　Ｕｎｉｏｎ　Ｈｏ￣ｉｔｌ　ｏａｆＪｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００３３，　Ｃｈｉａ；ｎ２．Ｙａｎｂｉａｎ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｐｅｏｐｌｅ￣Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｙａ．ｊｉ　１３３０００，Ｃｈｉａ）ｎ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｗｅｅｎ　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｐｅｒｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅｍｉａ，ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　ｒｅｄｕｃ—　ｔａｓｅ（ＭＴＨＦＲ）ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｋｅｙ　ｅｎｚｙｍｅ　ｏｆ　ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｃ　ａｃｉｄ（Ｈｃｙ）ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ａａｅｆｉｌａ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ｉｎ　ｙｏｕｔｈ．Ｍｅｔｈｏｄ　Ｕｓｉｎｇ　ｃａｓｅ　ｃｒｏｓｓ—ｃｈｅｃｋ　ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｈｃｙ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｂｏｔｈ　ｅｍｐｔｙ　ｓｔｏｍａｃｈ　ａｎｄ　ｐｏｓｔ—ｂｕｒｄｅｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ　ｗｅｒ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｈｉｇｈ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ王ｉｑｕｊｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ａ１２９８Ｃ　ｏｆ　ＭＴＨＦＲ　ａｍｏｎｇ　１００　ｙｏｕｎｇ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ａｒｔｅｒｉｌ　ｔａｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓａｒｌｌｅ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ—ＲＦＬＰ　ａｎｄ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｂｌｏｃｋａｇｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｙｐｏ　ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ａｌｌｅｌｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｒｏｕｐｓｇ　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｃｅ（Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＴＨＦＲ　Ａ１２９８Ｃ　ｃａｎ　ｒａｉｓｅ　Ｈｃｙ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｂｌｏｏｄ　ｐｌａｓｍａ．Ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ｎｏ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ａａｅｆｉｌ　ｔｈｒｏｍｂａｏｓｉｓ　ｉｎ　ｙｏｕｔｈ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＴＨＦＲ．　Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；Ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ；Ｙｏｕｔｈ；Ｃｅｒｅｂｒａｌ　ａｒｔｅｒｉａｌ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　血浆同型半胱氨酸（Ｈｃｙ）水平增高是缺血性脑卒中的独　立危险因素”Ｊ，有研究认为，轻、中度Ｈｃｙ浓度增高与脑卒中　的发生密切相关。Ｎ５，Ｎ，。一亚甲基四氢叶酸还原酶（ＭＴＨ—　制定的脑血管病诊断标准，确诊为缺血性脑卒中，均经头部　ＣＴ或ＭＲＩ证实；②年龄≤４５岁；③随机选取。排除标准：①　肺、肝、肾疾病、糖尿病、心源性栓塞、甲状腺疾病、银屑病、恶　ＦＲ）是Ｈｃｙ代谢的关键酶，Ｈｃｙ在转硫化和再甲基化过程中的　性肿瘤的患者；②脑栓塞、腔隙性脑梗死及ＴＩＡ患者；③无一、　二、三级血缘关系。对照组１００例，男７Ｏ例，女３Ｏ例，年龄　１８—４５岁，平均年龄（３８．５６±４．１０）岁，均为正常青年。　１．２方法　代谢酶ＭＴＨＦＲ基因突变可致血浆Ｈｅｙ浓度升高　。本研究　拟采用聚合酶链一限制性内切酶片段长度多态性分析（ＰＣＲ　—ＲＦＬＰ）和扩增阻滞突变体系法，对血浆同型半胱氨酸　（ＨＣＹ）代谢关键酶Ｎ　，Ｎ，。一亚甲基四氢叶酸还原酶（ＭＴＨ—　ＦＲ）基因Ａ１２９８Ｃ位点碱基突变与青年缺血性脑卒中的相关　性进行研究。　１．２．１血样采集：当日晨空腹抽取静脉血２ｍｌ以５％ＥＤＴＡ抗　凝，立即冰浴。均于１ｈ内以１　５００ｇ内离心ｌＯｍｉｎ，分别置血浆　及血清于一７０。Ｃ保存待测ＭＴＨＦＲ　Ａ１２９８Ｃ基因型。空腹采　血后即口服Ｌ一蛋氨酸０．１ｇ／ｋｇ（溶于２０Ｏｒａｌ橙汁中），服用后　４ｈ再次取血２ｍｌ，以５％ＥＤＴＡ抗凝，处理同前，一７０。Ｃ保存待　１临床资料　１．１一般资料：本组１０ｏ例，其中男７３例，女２７例，年龄２７　—测负荷后的同型半胱氨酸浓度。　４５岁，平均年龄（４１．５０±４．８０）岁。均为２００３年４月一　１．２．２实验方法：采用病例对照分析方法，以高效液相色谱　法测定受试者空腹及负荷后血浆Ｈｃｙ水平，以聚合酶链式反　应一限制性片段长度多态性分析法（ＰＣＲ—ＲＦＬＰ）分析检测　ＭＴＨＦＲ　Ａ１２９８Ｃ突变的基因型。　２００４年１２月发病２ｄ内的住院青年脑梗死病人，作为病例组。　人选标准：①１９９６年中华医学会第四次全国脑血管学术会议　通讯作者：南光贤　维普资讯

・８７８・　吉林医学２００７年７月第２８卷第７期　１．２．３　ＰＣＲ扩增：引物设计ＭＴＨＦＲ　Ａ１２９８Ｃ上游序列：５一　Ｃ１ＴｒＩ’ＧＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＣ。下游序列：５一ＣＡＣ１ＴｒＩ’ＧＴＧＡＣＣＡＴ－　ＴＣＣＧＧｒｒｒｒＧＰＣＲ，产物长８４ｂｐ。　胱氨酸，是细胞内蛋氨酸代谢产生的一种含巯基的氨基酸，存　在于人体多数组织内。１９６９年ＭｃＣｕｌｌｙ等　首次提出Ｈｃｙ可　能与动脉粥样硬化有关，其致血栓性疾病的作用己引起国内　外心脑血管病专家的极大关注。众多临床研究显示Ｈｃｙ与脑　梗死发病相关　，１９９７年Ｈｏｕｓｔｏｎ在对１００例镰状细胞病患　１．２．４反应条件：９４￣Ｃ预变性５ｍｉｎ；进人循环９４￣Ｃ变性３０ｓ，　５６￣Ｃ复性５０ｓ，７Ｏ℃延伸１ｍｉｎ；３８个循环后７２￣Ｃ延伸１０ｍｉｎ，　４￣Ｃ终止反应。ＰＣＲ反应结束后，取５仙ｌ扩增产物用２％琼脂　糖凝胶（内含ＥＢ）进行电泳。以１×ＴＡＥ为电泳缓冲液，１００Ｖ　者的资料分析中发现，其中伴卒中并发症的患者明显升高，多　元回归分析结果显示，Ｈｃｙ血浓度升高与脑卒中并发症之间　存在着独立相关性。脑血管疾病患者也常见血浆Ｈｃｙ浓度升　电泳３０ｍｉｎ。紫外灯下观察结果。酶反应条件：２Ｏ　反应体　系中加人２　缓冲溶液，Ｈｉｎ仃１５Ｕ，扩增产物１　，去离子水补　高，尤其以年轻脑卒中患者更为多见。Ｒｅｎｅ等报道　Ｊ，１４１例　足至２Ｏ　。放置于３７￣Ｃ恒温箱中３ｈ后取出。内切酶消化产　物用２％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下酶切结果。　１．３统计学处理：采用ＳＰＳＳ１０．０软件进行相关资料的比较　分析，计量资料数据以（　４－ｓ）表示，组问比较用Ｕ检验，计数　资料用ｘ　检验，计算各组等位基因频率，并按Ｈａｒｙ—Ｗｅｉｎｂｅｒｇ　平衡法检验样本的群体代表性。缺血性脑卒中是否发生与遗　传基因多态性的关联程度用优势比（Ｏｄｄｓ　ｒａｔｉｏ，ＯＲ）及其９５％　可信区间（Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｒｖａｌ，ＣＩ）表示。　１．４结果　１．４．１　ＭＴＨＦＲ　Ａ１２９８Ｃ基因型与青年缺血性脑卒中的关系：　ＭＴＨＦＲ基因扩增片段经Ｈｉｎｆｌ限制性内切酶消化后，发生Ａ—　Ｃ突变的基因片段将被切成长度为８４ｂｐ，其基因突变如图１。　ＣＣ　ＡＣ　ＡＣ　ＡＣ　ＣＣ　ＡＡ　ＣＣ　Ｍ　图１　ＭＴＨＦＲ　Ａ１２９８Ｃ基因型　１．４．２　ＭＴＨＦＲ　Ａ１２９８Ｃ基因检测：病例组和对照组基因型　分布和等位基因的频率（％／％）为纯合型４／３，杂合型４０／　３３，野生型５６／６４，突变等位基因４８／３９，未突变等位基因　１５２／１６１。ＭＴＨＦＲ　Ａ１２９８Ｃ基因检测病例组和对照组基因型　分布、纯合子频率和等位基因频率差异均无统计学意义　（Ｐ＞０．０５）。　１．４．３　血浆Ｈｅｙ浓度与ＭＴＨＦＲ基因型的关系：纯合型为　（１８．０４±３．９２）ｐ￣ｎｏＶＬ，杂合型为（１２．０６±３．０９）ｐ￣ｎｏＶＬ，野　生型为（１１．６８±４．１１）￣ｍｏｌ／＇Ｌ。经方差分析，ＭＴＨＦＲ　Ａ１２９８Ｃ　各基因型间血浆Ｈｅｙ浓度差异具有统计学意义（Ｐ＜０．００１）。　位点突变结果ＬＳＤ—ｔ检验显示，纯合型与杂合型，纯合型与　野生型血浆Ｈｅｙ浓度均数差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。　ＭＴＨＦＲ　Ａ１２９８Ｃ杂合型与野生型血浆Ｈｅｙ浓度均数差异无统　计学意义（Ｐ＞０．０５）。　２讨论　关于同型半胱氨酸作用机制的研究已从整体、器官、细胞　和分子不同水平大规模和深入进行。同型半胱氨酸又称高半　Ｈｃｙ患者中，５５％是通过ＭＬＴ发现的，而这些患者空腹血浆　Ｈｃｙ水平却表现正常，因而Ｈｃｙ必须包括空腹和／或负荷后血　浆Ｈｃｙ水平增高两种情况。　本研究从遗传基因变异的角度着重探讨了ＭＴＨＦＲ基因　多态性与Ｈｃｙ血症、青年缺血性脑卒中发病之间的关系。　ＭＴＨＦＲ基因是参与叶酸代谢的关键酶，所以与Ｈｃｙ的复甲基　化密切相关。本研究发现ＭＴＨＦＲ　Ａ１２９８Ｃ位点突变在两组分　布没有明显差别（尸＞Ｏ．０５），表明这些位点基因突变不是脑　梗死的潜在遗传候选因素。但测得ＭＴＨＦＲ　Ａ１２９８Ｃ位点突变　血浆Ｈｅｙ浓度均有显著差异（Ｐ＜０．０５）。　我们认为，脑血栓形成是多因素疾病，除与血浆Ｈｃｙ浓度　有关外，尚与其他因素如高血压、糖尿病、高血脂有关。血浆　Ｈｃｙ浓度除与遗传因素如Ｈｅｙ代谢酶基因突变有关外，环境　因素如Ｂ族维生素缺乏也可导致血浆Ｈｃｙ浓度升高，这是因　为在Ｈｃｙ转硫化和再甲基化过程中，维生素Ｂ　、维生素Ｂ，　和　叶酸作为辅酶参与代谢。可见基因突变对表型的作用在很大　程度上也受环境因素的影响，只有当基因突变所产生的微小　表型效应积累到一定程度，再加上环境因素的联合作用才会　导致疾病的发生。　３参考文献　［１］Ｐｅｒｒｙｌ　Ｊ，Ｒｅｆｓｕｍ　Ｈ，Ｍｏｒｒｉｓ　ＲＶ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｔｏｔａｌ　ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｉｓｋ　ｏｆ　ｓｔｒｏｋｅ　ｉｎ　ｍｉｄ—　ｄｌｅ—ａｇｅｄ　Ｂｒｉｔｉｓｈ　ｍｅｎ［Ｊ］．Ｔｈｅ　ｌａｎｃｅｔ，１９９５，３４６：１３９５．　［２］　Ｙｏｏ　ＪＨ，Ｃｈｏｉ　ＧＤ，Ｋａｎｇ　ＳＳ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ　ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｏｆｌａｔｅ　ｒｄｅｕｃｔａｓｅ　ｆｏｒ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ［Ｊ］．Ａｒ－　ｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｖａｓｃ　Ｂｉｏｌ，２０００，２Ｏ：１９２１．　［３］　ＭｃＣｕｌｌｙ　ＫＳ．Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅｍｉａ：ｉｍ－　ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆｒ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ，　１９６９，５６：１１１．　［４］　Ｃａｎｄｉｔｏ　Ｍ，Ｂｅｄｏｕｃｈａ　Ｐ．Ｔｏｔａｌ　ｐｌａｓｍａ　ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｄｅｔｅｒ－　ｍｉｎａｆｉｏｎ　ｂｙ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｂｅｆｏｒｅ　ａｎｄ　ａｆｔｅｒ　ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｌｏａｄｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ｂｉ—　ｏｍｅｄ　Ｓｃｉ　Ａｐｐｌ，１９９７，６９２（１）：２１３．　［５］　Ｖａｎ　Ｄｅｒ　Ｇｒｉｅｎｄ，Ｂｉｅｓｍａ　ＤＨ，Ｂａｎｇａ　ＪＤ．Ｈｙｐｅｒｈｏｍｏｃｙｓ—　ｔｅｉｎａｅｍｉａ　ａｓ　ａ　ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒ：ａｎ　ｕｐｄａｔｅ［Ｊ］．Ｎｅｔｈ　Ｊ　Ｍｅｄ，２０００，５６：１１９．　［６］Ｖａｎ　Ｄｅｒ　Ｇｒｉｅｎｄ　Ｒ，Ｈａｓｓ　ＦＪ，Ｄｕｒａｎ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｍｅｔｈｉｏａｉｎｅ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｔｅｓｔ　ｉｓ　ｎｅｃｅｓｓａｒｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｐｅｒｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅｍｉａ　［Ｊ］．Ｊ　Ｌａｂ　Ｃｌｉｎ　Ｍｅｄ，１９９８，１３２（１）：６７．　［收稿日期：２００７—０５—０８编校：刘冬娜］