中国汉坦病毒H8205株G1、G2-人源IL-2融合基因免疫效果的实验研究_百

2024-07-29 作者:

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・　ｌ３２　・　中国医学文摘・检验与临床２００７年第２１卷第３期　中国汉坦病毒Ｈ　８　２０５株Ｇ１、Ｇ２一人源ＩＬ一２　融合基因免疫效果的实验研究　熊　颖　张泽华　贾　珉　黄汉菊　汉坦病毒属于布尼亚病毒科，可致人类肾综合　为ｐｅＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ－　ＩＬ－２一Ｇ１；Ｄ组为ｐｅＤＮＡ３．１／　征出血热和汉坦病毒肺综合征。我国是世界上受其　危害最为严重的国家，寻找安全有效的疫苗是控制　该病流行和发生的关键，很多学者对此已有所研　究Ｉ１］。因病毒存在较广泛的变异，故有着良好社会　效益的汉坦病毒疫苗应是多价的，因为多价疫苗才　能提供最大程度的交叉保护性。汉坦病毒基因组为　－ｓｓＲＮＡ，分为Ｌ、Ｍ、Ｓ　３个片段，分别编码多聚　酶、囊膜糖蛋白（Ｇｌ、Ｇ２）及核衣壳蛋白，Ｇ１、　Ｇ２可凝集鹅红细胞活性和中和抗原表位。研究表　明，该病毒的血凝和中和位点位于囊膜糖蛋白Ｇ１　和Ｇ２上，因此，囊膜糖蛋白可作为研究疫苗的首　选对象。鉴于此，我们将汉坦病毒Ｈ８２０５株Ｇ１和　Ｇ２的ｃＤＮＡ重组人源ＩＬ－２基因后连人真核表达载　体ｐｅＤＮＡ３．１／Ｈｉ　Ｂ，形成重组真核表达载体　ｐｅＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ－ｔ　ＩＩ，２一Ｇ１一Ｇ２和ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ－　Ｂ－ＩＩ，２一Ｇ１（本室前期构建）。研究此两种融合基因　的免疫反应，讨论汉坦病毒Ｈ８２０５株Ｇ１、Ｇ２一人　源ＩＩ＿．－２融合基因真核载体ＤＮＡ疫苗的免疫保护效　果。　１实验材料和方法　１．１质粒的提取　质粒提取参照文献［　］进行，以紫外分光光度计　测定Ａｚ∞／ｚｓｏ　ｍｎ值，确定质粒ＤＮＡ的浓度及纯度，　并溶于生理盐水中调至ｌ　ｇ／　ｌ。　１．２　动物免疫　采用随机化的方式将３２只受试Ｂａｌｂ／ｃ小鼠　（雄性，鼠龄６周，ｌ４～ｌ８　ｇ，同济医学院实验动　物学部提供）分为４组，Ａ组为空白，．注射生理盐　水；Ｂ组为只注射空质粒ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ—Ｂ；Ｃ组　国家自然科学基金资助项目（Ｎ０．３０１７０８１９）　华中科技大学同济医学院附属同济医院第二临床学院　（武汉，４３００３０）　华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系　ＨｉｗＢ－ＩＬ－２－Ｇ１一Ｇ２。将小鼠常规麻醉、消毒后，在　其后肢股四头肌每侧肌注０．７５　布比卡因ｌＯ　ｌ，　以提高肌肉摄取质粒的能力。７２　ｈ后每侧注射重　组质粒５Ｏ　ｌ（每只小鼠共注射１００　ｇ）。每２周注　射相同剂量，免疫３次；断尾取血，分离血清于　ＥＰ管中，一２Ｏ℃保存，留作实验。　１．３抗体检测　１．３．１　ＥＬＩＳＡ方法检测血清中抗ＨＴＮＶ抗体的　滴度　取自制的汉坦病毒感染ＶｅｒｏＥ６细胞抗原片加　不同稀释度的免疫鼠血清，以辣根过氧化物酶　（ＨＲＰ）标记羊抗鼠ＩｇＧ（购于华美生物公司）为　二抗（１：ｌ　ｏｏｏ），邻苯二胺（ＯＰＤ）显色，并测　定各孔的　∞　值。　１．３．２空斑减少中和实验检测中和抗体　被检血清５６℃，３０　ｍｉｎ灭活，ｌ：ｌＯ稀释后　２倍系列稀释，与１００ＴＣＩＤ５０的ＨＴＮＶ混和，　３７℃，ｌ　ｈ，取０．１　ｍｌ混合液（３０－－－－５０　ＰＦＵ）接　种于生长在２４孔板内的非洲绿猴肾（Ｖｅｒｏ）细胞　（武汉市生物制品所狂犬病疫苗研制中心惠赠）单　层上，３７℃吸附１．５　ｈ，接种单纯覆盖含琼脂糖　培养基，３７℃培养６　ｄ，然后进行ＨＲＰ抗一ＨＴ—　ＮＶ染色，肉眼计数酶斑，与无血清孔比较，产生　５Ｏ　９／５抑制的血清最高稀释度的倒数为中和抗体的滴　度。　２结果　２．１小鼠血清特异性抗体　３次免疫后，Ａ组和Ｂ组ＩｇＧ的　∞　值无明　显变化，Ｃ组和Ｄ组ＩｇＧ的　∞　值高峰出现在第　６周３次免疫后。各组ＥＩ　ＩＳＡ检测结果为Ａ组　０．０５１　ｌ±０．１４２　０、Ｂ组０．０７２　５±０．０３２　０、Ｃ组　０．５０２　ｌ±０．１２１　０、Ｄ组０．５２４　５±０．１２８　０。详见　图ｌ。　维普资讯

中国医学文摘・检验与临床２００７年第２ｌ卷第３期　｝　军　；差　《　㈤　㈨　ｏ　图１各组ＥＬＩＳＡ检测结果　２．２　小鼠血清中特异性抗汉坦病毒中和抗体水平　Ｃ组和Ｄ组有中和抗体产生，前者滴度平均　值为１：７５．６４，后者滴度平均值为１：８５．３３，两　组间差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。结果显示注射　ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ—Ｂ—ＩＩ，２一Ｇ１一Ｇ２比注射ｐｃＤＮＡ３．１／　Ｈｉｓ－Ｂ－ＩＬ－２一Ｇ１诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠产生了更高水平的　中和抗体。而Ａ组和Ｂ组则无中和抗体产生。　３讨论　汉坦病毒Ｈ８２０５株为中国所特有，毒力强，具　有广谱的抗原性，属于汉坦型中的一个新亚型［３］。　本实验室前期已完成了重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ＿　１Ｌ＿２一Ｇ２、ｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉＳ－　Ⅱ，２－Ｇ１Ｅ　以及ｐｃＤ－　ＮＡ３．１／ＨｉＳ＿　ＩＩ，２＿Ｇ１一Ｇ２的构建工作。汉坦病毒变　异性高，给预防工作带来一定的难度，因此，研制　高效安全的疫苗意义重大。ＤＮＡ疫苗是一种不同于　传统疫苗的新型疫苗，由于能够有效地诱导机体细　胞毒Ｔ淋巴细胞（ＣＴＩ　）的细胞免疫应答，并且可　通过内源性抗原提呈系统激活ＣＴＬ细胞活性，从而　打破免疫耐受而成为目前研究的热点。　汉坦病毒基因分Ｌ、Ｍ、Ｓ　３个片段，分别编　码多聚酶、囊膜糖蛋白（Ｇ１、Ｇ２）及核衣壳蛋白。　研究已证实囊膜糖蛋白Ｇ１可刺激机体产生中和抗　体，但糖蛋白免疫原性较弱，特别是刺激机体细胞　免疫能力不强。汉坦病毒的包膜糖蛋白所编码的　Ｇ１、Ｇ２基因，在病毒的吸附、病毒膜与细胞膜的　融合、中和抗体的产生方面起着重要作用。因Ｇ２　只有在Ｇ１的辅助下才能分泌至细胞外进行表达，　所以我们的实验选择将Ｇ１和Ｇ２融合以增强保护　性；而ＩＬ－２作为Ｔｈｌ类细胞因子，对机体免疫功　能有很强的正向调节作用，为增强免疫原性，我们　・　１３３・　采用细胞因子ＩＩ　一２作为佐剂。大多数研究表明，　在同时注射了含ＩＬ－２［　］等基因的重组质粒后，发　生了Ｔｈｌ占优势的免疫应答，因此我们考虑将构　建的重组质粒中插入表达ＩＩ，２的基因片段以期其　表达的融合蛋白能提高抗体免疫应答水平。　本研究结果显示，Ｃ组和Ｄ组中和抗体的效　价明显高于Ａ组和Ｂ组（Ｐ＜０．０５），且Ｄ组抗体　的效价高于Ｃ组，但差异无显著性．考虑可能与　免疫次数有关，如果实验继续在免疫３次之后再加　强２－－￣３次，可能差异明显。另外我们构建的融合　基因虽然免疫效果有所增强，但是中和抗体效价还　没有达到预期程度，在小鼠接种方法上，基因枪免　疫法的ＤＮＡ输送效率及免疫保护作用明显高于注　射法，因本实验条件有限，用的是基本的针管注　射，ＤＮＡ的输送效率及免疫保护作用一定程度上　受到影响［６３，因而本研究疫苗抗体滴度不高可能与　接种途径及免疫次数不够有关。　参考文献　［１］Ｈ０ＯＰＥＲ　Ｊ　Ｗ，ＣＵＳＴＥＲ　Ｄ　Ｍ，ＴＨＯＭＰＳ０Ｎ　Ｅ，ｅｔ　ａＬ　ＤＮＡ　ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｈａｎｔａａｎ　ｖｉｅｒｓ　Ｍ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｓ　Ｈａｍｓｔｅｒｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｒｅｅ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ＨＦＲＳ　Ｈａｎｔａ—　ｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　ｅｌｉｃｉｔｓ　ａ　ｈｉｇｈ－ｔｉｔｅｒ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅ－　ｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　Ｒｈｅｓｕｓ　ｍｏｎｋｅｙｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｏｒｌ，２００１，７５　（１８）：８４６９－８４７７．　Ｉ－ｚ］　ＢＲ００Ｋ　Ｊ，ＦＲＩＴＳＣＢ　Ｅ　Ｆ，ＭＡＮＩＡＴＩＳ　Ｔ，ｅｔ　ａＬ　Ｍｏｌｃｅｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎａｌ［Ｍ］．２ｔｈ　ｅｄ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９：２４－３４．　［３３　ＲＯＢ　『ＳＯＮ　Ｈ　Ｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｖａｃｃｉｎｅｓ：ａｎ　ｏｖｅｒｖｉｅｗ　ＥＪ－Ｉ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９７，１５（８）：７８５—７８７．　［４］孙辉，关武祥，黄汉菊．汉坦病毒Ｈ８２Ｏ５株Ｇ１一人源　ＩＬ－２融合基因的克隆与表达ＥＪ－Ｉ．华中科技大学学报　（医学版），２００３，３２（６）：５７８—５８１．　［ｓＪ罗红雨，杨旭，苏先狮．插入１Ｌ－２基因优化ＨＢＶ　ＤＮＡ疫苗的研究ＥＪ－］．中国免疫学杂志，２００２，１８　（５）：３０１—３０４．　［６］ＦＥＬＴＱＵＡＴＥ　Ｄ　Ｍ，ＨＥＡＮＥＹ　Ｓ，ＷＥＢＳＴＥＲ　Ｒ　Ｇ，　ｅｔ　ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｔ　ｈｅｌｐｅｒ　ｃｅｌｌ　ｔｙｐｅｓ　ａｎｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｓｏｔｙｐｅｓ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｓａｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｇｕｎ　ＤＮＡ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ＥＪ－Ｉ．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７，１５８（５）：２２７８—２２８４．　（收稿日期：２ｏｏ７－０３—１２）