GFP—HPVl8 E2删除突变体融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

2024-07-29 作者:

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第３５卷第５期　南华大学学报・医学版　Ｊｏｕｒｎｌａ　ｏｆ　Ｎａｎｈｕａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）　２００７年９月　Ｓｅｏ．２００７　ＧＦＰ—ＨＰＶ１８　Ｅ２删除突变体融合蛋白真核　表达载体的构建与鉴定　陈春莲ｈ　，彭俊　，余敏君　，尹卫国　，朱翠明　，万艳平　（１．南华大学病原生物学研究所，湖南衡阳４２１００１；２．桂林医学院附属医院内科）　摘要：目的　构建人乳头瘤病毒１８型早期蛋白２（ＨＰＶ１８　Ｅ２）￣ｔ４除突变体Ｎ端（ＴＡＤ）、Ｃ端（ＤＢＤ）　与增强型绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）融合蛋白的真核表达载体，为研究ＨＰＶ１８　Ｅ２基因与宫颈癌发生的关系提　供实验基础。方法　用ＰＣＲ扩增ＨＰＶ１８　Ｅ２　ＴＡＤ、ＤＢＤ基因序列，用ＥｃｏＲ　Ｉ和ＢａｍＨ　Ｉ双酶切ｐＥＧＦＰ—　Ｃ１载体与ＴＡＤ、ＤＢＤ基因ＰＣＲ产物，纯化回收后，用连接酶连接并转化大肠杆菌ＪＭ１０９，筛选阳性克隆，　并对其进行双酶切和测序鉴定。结果　阳性克隆质粒经双酶切后，琼脂糖凝胶电泳可见４．７　ｋｂ、６１８　ｂｐ　和２４３　ｂｐ附近的片段。ＤＮＡ测序结果经与ＧｅｎＢａｎｋ登录的序列做ＢＬＡＳＴ分析，显示重组质粒分别含有　６１８　ｂｐ与２４３　ｂｐ的目的基因片段，无碱基错配和移码突变，读码框完全正确。结论—成功地构建了ＧＦＰ　ＨＰＶ１８　Ｅ２删除突变体融合蛋白真核表达载体ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＴＡＤ与ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＤＢＤ。　关键词：人乳头瘤病毒；　Ｅ２基因；　绿色荧光蛋白；　真核表达　中图分类号：Ｒ３７３　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７２—７４４４（２００７）０５—０６４３—０３　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｉｆｏｎ　ｏｆ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｆ０ｒ　Ｍｕｔａｎｔ　ｏｆ　ＨＰｖ　１８　Ｅ２　Ｆｕｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ＧＦＰ　ＣＨＥＮ　Ｃｈｕｎ—ｂａｎ，ＰＥＮＧ　Ｊｕｎ，ＹＵ　Ｍｉｎ—ｊｕｎ。ｅｔ　ａｌ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＰａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｈｕａ　，Ｈｅｎｇｙａｎｇ，Ｈｕｎａｎ　４２１００１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅ２　ｇｅｎｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｕｔｅｒｉｎｅ　ｃｅｒｖｉｘ　ｃａｎｃｅｒ，ｔｈｉｓ　ｒｅ—　ｓｅａｒｃｈ　ｗａｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｎ——ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ　ｎｄ　Ｃ—ａ—ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ　ｄｅｌｅｔｄ　ｍｕｔｅａｎｔ　ｏｆ　ＨＰＶ１８　Ｅ２（ＴＡＤ，ＤＢＤ）ｆｕｓｅｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｗｉｈｔ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＴＡＤ　ｎｄ　ＤＢＤ　ｇｅｎｅ　ａｉｔｗｈ　ＥｃｏＲ　Ｉ　ａｎｄ　ＢａｍＨ　Ｉ　ｅｎｄｏｅｎｚｙｍｅ　ｓｉｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ｒｅｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＥＧＦＰ—Ｃ　１　ｖｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｂｙ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．　Ｒｅ－　ｓｕｉｔｓ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗｅｒｅ　ｃｏｒｒｅｃｔ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　Ｎ—ｅｘｔｒｅｍｉｙ　ａｔｎｄ　Ｃ—ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ　ｄｅｌｅｔｅｄ　ｍｕｔａｎｔ　ｏｆ　ＨＰＶ１　８　Ｅ２　ｆｕｓｅｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｗｉｔｈ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ＧＦＰ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＨＰＶ；Ｅ２　ｇｅｎｅ；ＧＦＰ；ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）高　危型如ＨＰＶ１６、１８等常引起重度不典型性增生，　基金项目：湖南省自然科学基金（ｏ６Ｊ．Ｉ４１０８）．　通讯作者：万艳平，Ｅ—ｎｍｉｌ：ｙａｎｐｉｎｇｗａｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ＣＯｌｌｌ　甚至恶性肿瘤…。ＨＰＶ１８是一种无包膜的环状病　毒，早期基因区编码Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４和Ｅ７等６种蛋　６４３　维普资讯

白，其中Ｅ２蛋白既调节病毒的转录又调节病毒的　复制，并能通过多种途径影响细胞增殖。Ｅ２蛋白　由３６５个氨基酸（ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ）组成，分为２个结构　域，Ｎ端转录活化结构域（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ，　ＴＡＤ），由２０６个氨基酸组成；Ｃ端ＤＮＡ结合域　（ＤＮＡ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ，ＤＢＤ），由８Ｏ个氨基酸组　成；中间是一个可变的铰链区（Ｈｉｎｇｅ），由７９个氨　基酸组成　。　本文通过构建ＨＰＶ１８　Ｅ２删除突变体Ｎ端　ＴＡＤ、Ｃ端ＤＢＤ与增强型绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）融　合蛋白的真核表达载体，以便为ＨＰＶ１８　Ｅ２蛋白Ｎ　端与Ｃ端结构域在真核细胞中表达的定位与功　能研究奠定实验基础。　１　材料与方法　１．１材料真核表达载体ｐＥＧＦＰ—Ｃ１、ｐＥＧＦＰ—　ＣＩ／ＨＰＶ１８　Ｅ２由法国巴斯德研究所Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ　Ｔｈｉ—　ｅｒｒｙ教授惠赠、Ｅ．ｃｄｉ　ＪＭ１０９为本研究所保存。　ＰＣＲ相关试剂、Ｔ４连接酶、ＥｃｏＲ工和ＢａｍＨ工限制　性内切酶购自深圳晶美生物工程有限公司；１００　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ和ＤＮＡ胶回收试剂盒购自上海生　工生物工程技术服务有限公司；ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ１５　０００购自Ｔａｋａｒａ公司。　１．２　ＰＣＲ扩增ＨＰＶ１８　Ｅ２删除突变体ＴＡＤ与　ＤＢＤ基因片段根据ＨＰＶ１８　Ｅ２基因序列，采用　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０软件分别设计两对特异性引　物，并引入Ｅｃ０Ｒ工和ＢａｍＨ工酶切位点。扩增　ＴＡＤ的弓Ｉ物Ｐｌ：５’一ＧＴＡ　ＧＡＡ　ＴＦＣ　ＣＡＴ　ＧＣＡ　ＧＡＣ　ＡＣＣ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＡＡＣ一３’；弓Ｉ物Ｐ２：５’一ＣＣＣ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＣＡＴ　ＡＧＡ　ＧＴＣＡ１Ｔ　ＡＣ一３’。扩增　ＤＢＤ的弓Ｉ物Ｐｌ：５’一ＧＣＧ　ＡＡＴ　ＴＣＣ　ＡＣＴ　ＡＣＧ　ＣＣＴ　Ａｌ１ＩＡ　ＡＴＡ　Ｃ一３’；弓Ｉ物Ｐ２：５’一ＧＣＣ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　Ｔ１１Ａ　ＣＡＴ　ＴＧＴ　ＣＡＴ　ＧＴＡ　ＴＣＴ一３’。引物由上海生工生　物工程技术服务有限公司合成。将质粒ｐＥＧＦＰ—　Ｃ１／Ｅ２稀释ｌＯ倍作为ＰＣＲ反应的模板。ＴＡＤ、　ＤＢＤ　ＰＣＲ反应体系均如下：在２５　反应体系中　依次加入模板１．０　、两对２０／ａｎｏｌ／Ｌ的引物各　０．５　、２．５　１０×反应缓冲液、２５　ｔｎｎｏｌｌＬ的　ＭｇＣｌ２　２．０　Ｌ、Ｔａｑ酶０．２　Ｌ、１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ　１／ｚＬ、　补水至２５　（ＴＡＤ、ＤＢＤ除引物特异外其它均相　同）。ＰＣＲ反应参数如下：９４￣Ｃ预变性５　ｍｉｎ，９４￣Ｃ　变性３０　Ｓ，ＴＡＤ　５６ｏＣ退火４５　Ｓ、ＤＢＤ　５１　ｏＣ退火４５　Ｓ，　６４４　７２￣Ｃ延伸４５　ｓ，３５个循环；７２￣Ｃ终延伸１０　ｍｉｎ。取　６　Ｌ　ＰＣＲ产物进行１．２％琼脂糖凝胶电泳。　１．３重组质粒ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＴＡＤ、ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＤＢＤ　的构建将ＰＣＲ产物与质粒ｐＥＧＦＰ—Ｃ１用ＥｃｏＲ　工和ＢａｍＨ工双酶切后，经１．２％琼脂糖凝胶电　泳，ＤＮＡ胶回收试剂盒分别回收约６１８　ｂｐ与２４３　ｂｐ片段和４．７　ｋｂ的ｐＥＧＦＰ—Ｃ１片段。在ｌＯ　连接反应体系中分别加入６　回收的目的基因　片段和２　回收的ｐＥＧＦＰ—Ｃ１片段、０．４　Ｔ４　连接酶、１．０　１０×反应缓冲液，补水至ｌＯ　。　１６￣（２连接过夜后，以ＣａＣｌ＝法制备感受态细胞　ＪＭ１０９，分别将连接产物５　转化感受态ＪＭ１０９　中Ｌ３］，然后分别铺于含卡那青霉素５０￣ｇ／ｍＬ的ＬＢ　平板上，３７￣Ｃ培养过夜。　１．４重组质粒ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＴＡＤ、ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＤＢＤ　的鉴定挑取单克隆菌扩增，用碱裂解法提取质　粒。所提质粒分别以ＥｃｏＲ工和ＢａｍＨ工双酶切，　１．２％琼脂糖凝胶电泳。酶切鉴定后的重组质粒　送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测　序结果登录ＧｅｎＢａｎｋ作ＢＬＡＳＴ分析。　２结　果　２．１　ＰＣＲ扩增ＴＡＤ与ＤＢＤ基因ＰＣＲ扩增后，　经１．２％琼脂糖凝胶电泳显示在约６００—７００　ｂｐ、　２００—３００　ｂｐ之间各有一明显条带（图１）。　ｂｐ　６１８　２４３　图１　ＰＣＲ扩增　ＦＡＤ、ＤＢＤ基因产物琼脂糖凝胶电泳结果　１．ＴＡＤ扩增产物；２．阴性对照；３．ＤＢＤ扩增产物；４．阴性对照：５　１００　ｂｐＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　２．２重组载体ｐＥＧＦＰ—ＣＩ／ＴＡＤ与ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／　ＤＢＤ的鉴定　重组质粒ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＴＡＤ、ｐＥＧＦＰ　—Ｃ１／ＤＢＤ分别经ＥｃｏＲ　Ｉ和ＢａｍＨ工双酶切，均可　维普资讯

切出２个片段，大片段迁移率与ｐＥＧＦＰ—Ｃ１空质　粒酶切后的迁移率接近，约５　０００　ｂｐ；小片段分别　位于核酸标准分子量６００～７００　ｂｐ、２００～３００　ｂｐ之　间，分别与目的基因ＴＡＤ、ＤＢＤ大小一致（图２）。　测序结果登录ＧｅｎＢａｎｋ进行ＢＬＡＳＴ分析，重组质　粒分别含有６１８　ｂｐ、２４３　ｂｐ目的基因片段，无碱基　错配和移码突变，且分别与ＨＰＶ１８　Ｅ２　ＴＡＤ和　ＤＢＤ读码框完全一致（数据未显示）。　∞　∞　∞　∞　：００　１０００　硼　３Ｏ０　１Ｏ０　图２　ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＴＡＤ、ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＤＢＤ的双酶切鉴定结果　１．１００　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；２．ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＴＡＤ双酶切；３．ＴＡＤ　ＰＣＲ产　物；４．ｐＥＣＦＰ—Ｃ１／ＤＢＤ双酶切；５．ＤＢＤ　ＰＣＲ产物；６．ｐＥＧＦＰ—ｃ１　双酶切；７．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ１５０００　３　讨　论　高危型ＨＰＶ与宫颈癌、肛管癌、肺癌、食管　癌、膀胱癌、大肠癌等恶性肿瘤的病因学密切相　关，据统计全球每年约有５０万妇女死于由ＨＰＶ１６　和ＨＰＶ１８引起的子宫颈鳞状细胞癌。研究发现，　在宫颈上皮内瘤变前期Ｅ２蛋白高表达，而后期　病变和高度恶性的宫颈癌中，存在Ｅ２蛋白去表　达、Ｅ６、Ｅ７癌蛋白高表达的现象　Ｊ。在与ＨＰＶ１８　相关的宫颈癌中，常发现其ＤＮＡ整合于宫颈癌细　胞基因组，但在该整合过程中，通常存在Ｅ２基因　的缺失，缺少Ｅ２蛋白的表达是ＨＰＶ１８致宫颈癌　的一个重要标志　５　Ｊ。而且，在ＨＰＶ１８感染的宫颈　癌细胞中，重新引人Ｅ２基因可以抑制ＨＰＶ致癌　基因Ｅ６、Ｅ７的表达，使细胞周期终止于ｃ１期，细　胞发生衰老或凋亡　Ｊ。这些结果表明，Ｅ２蛋白在　癌变过程中可能发生负调控的作用。Ｂｌａｅｈｏｎ　等　发现Ｅ２蛋白诱导细胞凋亡的能力与其在细　胞内的定位相关，低危型ＨＰＶ　６、ＨＰＶ１１　Ｅ２蛋白　严格定位于细胞核内，而高危型ＨＰＶ　１６、ＨＰＶ１８　Ｅ２蛋白既存在于细胞核内又存在于细胞质内。　本研究利用增强型ＧＦＰ强烈的自发荧光性质，构　建了ＧＦＰ—ＨＰＶ１８　Ｅ２删除突变体ＴＡＤ或ＤＢＤ融　合蛋白真核表达载体ｐＥＣＦＰ—Ｃ１一ＴＡＤ与ｐＥＧＦＰ　～Ｃ１一ＤＢＤ，其目的是为了研究Ｅ２蛋白删除突变　体ＴＡＤ及ＤＢＤ与Ｅ２蛋白在细胞定位中的作用，　以便探索它们在宫颈癌发生机制中的作用。目　前，本所正在研究其在真核细胞中的表达，∞　利用倒　置荧光显微镜观察Ｅ２蛋白Ｎ端和Ｃ端结构域在　真核细胞中的表达定位。　参考文献：　［１ｊ　Ｍｕｎｏｚ　Ｎ，Ｂｏｓｃｈ　ＦＸ，ｄｅ　Ｓａｎｊｏｓｅ　Ｓ，ｅｔ　３１．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｅ　ｃｌａｓｓｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉＵｏｍａｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｅｒｖｉｃａｌ［Ｊ］．Ｎ　Ｅ　Ｊ　Ｍｅｄ，２００３，３４８（６）：５１８—５２７．　［２ｊ　Ｄｅｌｌ　Ｇ，Ｇａｓｔｏｎ　Ｋ．ＣｏｎｔｒｉｂｕｔｉＯＲＳ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｒ６ｓｅａｒｅｈ－＂ｒｅｖｉｅｗ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ［ＪＪ．ＣＭＬＳ，２００１，５８：１９２３—１９４２．　［３］黄培堂．分子克隆实验指南．第３版［Ｍ］．北京：科学　出版社，２００２．　［４］　Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ　Ｍ，Ｈｕｄｓｏｎ　ＬＣ，Ｂｕｍｓ　ＪＥ，ｅｔ　３１．Ｉｎｖｅｒｓｅ　ｒｅｌａ—　ｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒ－　ＵＳｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＥ２　ａｎｄ　ｖｉｒｕｓＤＮＡ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒｄｕｒ—　ｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｎｅｏｐｌａｓｉａ［Ｊｊ．　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ，２０００，８１：１８２５—１８３２．　［５ｊ　Ｃｏｒｄｅｎ　ＳＡ，Ｓａｎｔ—ＣａｓｓｉａＬＪ，ＥａｓｔｏｎＡＪ，ｅｔ　３１．Ｔｈｅｉｎｔｅ—　ｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉ　一１８　ＤＮＡ　ｉｎ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｐａｔｈｏｌ，１９９９，５２（５）：２７５—２８２．　［６ｊ　Ｇｏｏｄｗｉｎ　ＥＣ，Ｄｉ　Ｍａｉｏ　Ｄ．Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａ・　ｖｉｒｕｓ　ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ＨｅＬａ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｃａｕｓｅｓ　ｔｈｅ　ｏｒｄｅｒｌｙ　ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｏｒｍａｎｔ　ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｐａｔｈ・　ｗａｙｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｌｉ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２０００，９７（２３）：１２５１３　—１２５１８．　［７］Ｂｌａｃｈｏｎ　Ｓ，Ｂｅｌｌａｎｇｅｒ　Ｓ，Ｄｅｍｅｒｅｔ　ｃ，ｅｔ　３１．Ｎｕｃｌｅｏ—ｃｙ・　ｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｓｈｕｔｔｌｉｎ￣ｏｆ　ｈｉ曲ｒｉｓｋ　ｈｕｍａｎ　ＰａｐｉＵｏｍａｖｉｒｕ￣Ｅ２　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００５，２８０　（４３）：３６０８８—３６０９８．　（收稿日期：２ＯＯ７—０３一ｌ１）　６４５