GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在真核细胞内的表达与定位

2024-07-29 作者:

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第２Ｏ卷第６期　２００７年１Ｏ月　华夏医学　Ｖ０１．２Ｏ　Ｎｏ．６　０ｃｔ．２００７　Ａｃｔａ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｅ　Ｓｉｎｉｃａ　ＧＦＰ—ＨＰＶ１８　Ｅ２及其突变体融合蛋白在真核细胞内的表达与定位①　陈春莲　，万艳平ｚ，彭俊ｚ　（１．桂林医学院附属医院老年科，广西桂林５４１００１；　２．南华大学病原生物学研究所，湖南衡阳４２１００１）　摘要：目的：研究ＨＰＶ１８　Ｅ２及其Ｎ端（ＴＡＤ）、Ｃ端（ＤＢＤ）与ＧＦＰ融合蛋白在巨噬细胞（Ｍ　）内的表达与定位。方法：　将真核表达载体ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／Ｅ２、ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＴＡＤ和ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＤＢＤ及ｐＥＧＦＰ—Ｃ１分别转染Ｍ　，４８ｈ后用倒置荧光　显微镜观察荧光情况，以确定ＧＦＰ及融合蛋白的表达；以抗ＧＦＰ抗体为一抗作Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测相应蛋白质的表达。　结果：在荧光显微镜下，４种质粒转染的细胞．ｐＥＧＦＰ—Ｃ１组细胞内均有荧光；ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／Ｅ２组荧光主要在细胞核，但　细胞浆也有；ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＤＢＤ仅在细胞核有荧光，ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＴＡＤ仅在细胞浆有荧光。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测到ＧＦＰ—　ＨＰＶＩ８　Ｅ２及其突变体融合蛋白在细胞内的表达。结论：ＧＦＰ—Ｅ２及其突变体融合蛋白均能在巨噬细胞内表达，且　ＧＦＰ—Ｅ２主要定位于细胞核，ＧＦＰ—ＤＢＤ定位于细胞核内，ＧＦＰ—ＴＡＤ定位于细胞浆。　关键词：人乳头瘤病毒ｌ８型；Ｅ２蛋白；定位　中图分类号：Ｒ３７３．９　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８—２４０９（２００７）０６—１１８８—０２　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧＦＰ—ＨＰＶｌ８　Ｅ２　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｃｅｌＩｓ／ＣＨＥＮ　Ｃｈｕｎ－ｌｉａｎ。　ＷＡＮ　Ｙａｎ—ｐｉｎｇ，ＰＥＮＧ　Ｊｕｎ／／Ｔｈｅ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇｕｉｌｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｌｉｎ　５４１００１，Ｃｈｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｉｅｃｔｉｖｅ：Ｔ０　ｓｔｕｄｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧＦＰ—ＨＰＶ１８　Ｅ２　ａｎｄ　ｉｔｓ　ＴＡＤ　ｏｒ　ＤＢＤ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｏｆ　ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／Ｅ２，ｐＥＧＦＰ－Ｃ１／ＴＡＤ，ｐＥＧＦＰ－Ｃ１／ＤＢＤ　ｏｒ　ｐＥＧＦＰ－Ｃ１　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｉｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｗｉｔｈ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｍｉｃｒｏ—　ｓｃｏｐｅ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ＧＦＰ　ｏｒ　ｉｔｓ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ—ＧＦＰ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｓ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ａｎｔｉｂｏｄｙ．　Ｒｅｓｕｈｓ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｐＥＧＦＰ—Ｃｌ，ｍａｉｎｌｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｉ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／Ｅ２，ｂｕｔ　ｏｎｌｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｉ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＤＢＤ　ｗｈｉｌｅ　ｏｎｌｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｙ—　ｔｏｐｌａｓｍａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｐＥＧＦＰ—Ｃ　１／ＴＡＤ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＧＦＰ，ＧＦＰ—Ｅ２，　ＧＦＰ－ＤＢＤ，ＧＦＰ—ＴＡＤ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＧＦＰ—ＨＰＶｌ８　Ｅ２　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｃｏｕｌｄ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｉｎ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．　ＧＦＰ—Ｅ２　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｏｃａｔｅ　ｍａｉｎｌｙ　ｉｎ　ｎｕｃｌｅｉ。ｗｈｉｌｅ　ＧＦＰ—ＤＢＤ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｏｃａｔｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ　ｉｎ　ｎｕｃｌｅｉ　ａｎｄ　ＧＦＰ—　ＴＡＤ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｏｃａｔｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ　ｉｎ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍａ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＨＰＶ１８；Ｅ２；ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）１８型　（ＨＰＶｌ８）属高危型，可引起重度不典型性增生，甚至恶性肿　瘤［１］。ＨＰＶＩ８早期基因区编码的Ｅ２蛋白由３６５个氨基酸　（ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ，ａａ）组成，分为Ｎ端转录活化结构域（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａ—　ｔｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ，ＴＡＤ）和Ｃ端ＤＮＡ结合域（ＤＮＡ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏ—　后，在细胞内的表达与定位情况。　１材料和方法　１．１材料　真核表达载体ｐＥＧＦＰ—Ｃ１、ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＨＰＶ１８　Ｅ２、　ｍａｉｎ，ＤＢＤ），前者有２０６ａａ，后者有８０ａａ；两者中间为可变的铰　链区（ｈｉｎｇｅ），有７９ａａ【２］。Ｅ２蛋白既调节病毒的转录又调节病　毒的复制，且通过多种途径影响细胞增殖。巨噬细胞　（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，Ｍ　）是机体抗肿瘤免疫中的重要效应细胞。　ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＴＡＤ和ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＤＢＤ由本室保存［４］，人单核细　胞白血病ＴＨＰ—ｌ细胞购自中国典型培养物保存中心（武汉）。　低温高速离心机是ＨＥＴＴＩＣＨ公司产品；倒置荧光显微镜是　日本Ｎｉｋｏｎ公司产品。Ｓｏｆａｓｔ　转染试剂购于厦门太阳马生物　有限公司。兔抗ＧＦＰ抗体购于ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司，ＨＲＰ标记羊　ＨＰＶ感染后，在真皮基质可检测到大量的Ｍ　。本研究报道　ＧＦＰ—ＨＰＶ１８　Ｅ２及其突变体融合蛋白真核表达载体转染细胞　抗兔ＩｇＯ购自Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司。　①基金项目：湖南省教育厅资助项目（０２Ｃ３９１）。　②作者简介：陈春莲（１９６４一），１９８６年毕业于中南大学湘雅医学院，获学士学位．２００６年毕业于华中科技大学同济医学院，获硕士学位，现为桂　林医学院附属医院老年科副教授。　・ｌ１８８・　维普资讯

第６期　１．２方法　陈春莲等：ＧＦＰ—ＨＰＶ１８　Ｅ２及其突变体融合蛋白在真核细胞内的表达与定位　３讨论　第２Ｏ卷　悬浮细胞ＴＨＰ一１在体外培养经佛波脂（ＰＭＡ）活化后可　分化为贴壁的Ｍ　［５］。转染前３　ｄ，ＴＨＰ一１细胞用按０．４Ｘ　１０。细　胞／Ｌ转入２４孔板，每孔ｌｍｌ，培养２４ｈ后加入终浓度为４０　ｇ／　Ｉ　的ＰＭＡ诱导４８　ｈ。用新鲜培养基洗涤细胞后每孔分别加入　３种重组质粒及ｐＥＧＦＰ—Ｃ１各０．５　ｂｔｇ，同时作空白对照，用Ｓｏ—　ｆａｓｔＴＭ转染试剂按说明书转染细胞。细胞转染后６　ｈ，用新鲜　在与ＨＰＶ１８相关的宫颈癌中，缺少Ｅ２蛋白的表达是　ＨＰＶ１８所致富颈癌的一个重要标志，若在其癌细胞中重新引　入Ｅ２基因可以抑制ＨＰＶ致癌基因Ｅ６，Ｅ７的表达，使细胞周期　阻滞止于Ｇ１期，细胞可发生衰老或凋亡［６］，说明Ｅ２蛋白在癌　变过程中可能发生负调控的作用。　Ｍ　具有较强吞噬和杀伤能力，可调控局部细胞微环境　及抑制肿瘤，并能呈递抗原和产生ＴＮＦ—ａ，ＩＬ一１ｔ３等细胞因子，　培养基洗涤２次，每孔加ｉｍｌ培养基继续培养。用倒置荧光显　微镜观察绿色荧光的表达与定位，在表达荧光细胞数量最多　时收集细胞，置４℃下加入５Ｏ　ｌ细胞裂解液３Ｏ　ｍｉｎ，１００００ｒ／　ｍｉｎ　４℃离心５ｍｉｎ．收获细胞裂解上清液经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ后，以　抗ＧＦＰ抗体为一抗作Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ鉴定。　２结果　经倒置荧光显微镜观察，重组质粒能在细胞内表达，其定　位如图１所示。ＧＦＰ—ＤＢＤ融合蛋白完全表达定位于细胞核内，　ＧＦＰ—ＴＡＤ完全表达定位于细胞浆，ＧＦＰ—Ｅ２、ＧＦＰ在细胞核、　浆内均有表达，但ＧＦＰ—Ｅ２表达组细胞核荧光亮度强于细胞胞　浆，ＧＦＰ在细胞核浆内呈均匀表达。转染４８　ｈ后发荧光细胞数　量最多，收集此时的细胞裂解，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果见图２。图中　相对分子质量（Ｍｒ）约２９４００，５３４００，７０７００，３８６００的条带分别　与预期ＧＦＰ，ＧＦＰ—ＴＡＤ，ＧＦＰ—Ｅ２，ＧＦＰ—ＤＢＤ大小一致。　■■■　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＧＦＰ　ＧＦＰ．ＤＢＤ　■■　ＧＦＰ－ＴＡＤ　ＧＦＰ．Ｅ２　图ｌ重组质粒在细胞中表达的荧光显微照片（Ｘ　４００）　Ｃｏｎｔｒｏｌ：对照｝ＧＦＰ：荧光素蛋白；ＧＦＰ—ＤＢＤ：荧光索一ＨＰＶ１８　Ｅ２　ＤＮＡ结合结构域融合蛋白ＧＦＰ—ＴＡＤ：荧光索一ＨＰＶ１８　Ｅ２转活性　结构域融合蛋白；ＧＦＰ—Ｅ２：荧光素一ＨＰＶ１８　Ｅ２　１　２　３　４　５　Ｊ￣／ｌ０　７Ｏ．７　５３．４　３８．６　２９．４　图２　重组质粒在Ｍ　表达产物的Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析　１：巨噬细胞裂解物；２：ｐＥＧＦＰ—Ｃ１转染的巨噬细胞裂解物；　３：ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＴＡＤ转染的巨噬细胞裂解物；４：ｐＥＧＦＰ　Ｃ１／Ｅ２转染　的巨噬细胞裂解物；５：ｐＥＧＦＰ—Ｃ１／ＤＢＤ转染的巨噬细胞裂解物　参与机体特异性免疫应答。ＨＰＶ１８　Ｅ２蛋白Ｎ端结构域含有一　段核输出序列（ｎｕｃｌｅａｒ　ｅｘｐｏｒｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＮＥＳ），Ｃ端结构域含　有一段核定位序列（ｎｕｃｌｅａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＮＬＳ）［　。将　ＨＰＶ１８　Ｅ２及其ＴＡＤ、ＤＢＤ与ＥＧＦＰ融合蛋白载体在Ｍ　中瞬　时高表达发现，ＧＦＰ—ＤＢＤ融合蛋白完全表达于细胞核内，　ＧＦＰ—ＴＡＤ完全表达于细胞浆，ＧＦＰ—Ｅ２、ＧＦＰ在细胞核、浆内　均有表达，但ＧＦＰ—Ｅ２主要表达于细胞核内。笔者在后续的研　究中发现ＧＦＰ—Ｅ２、ＧＦＰ—ＴＡＤ在体外培养的Ｍ　中瞬时即时　高表达上调其ＴＮＦ—ａ和ＩＬ—ｌ８分泌水平，推测Ｅ２蛋白对ＨＰＶ　感染者体内细胞因子水平的改变以及免疫应答方面起重要作　用，结果将在相关论文中报道。至于ＨＰＶ１８　Ｅ２蛋白上调Ｍ　分泌ＴＮＦ—ａ对机体起何种作用及其机制目前尚不清楚，有待　进一步探讨。　参考文献：　［１］ＭＵＮＯＺ　Ｎ。ＢＯＳＣＨ　Ｆ　Ｘ，ＤＥ　ＳＡＮＪＯＳＥ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｃｅｒ—　ｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ。２００３。３４８（６）：５１８—５２７．　［２］ＤＥＬＬ　Ｇ，ＧＡＳＴＯＮ　Ｋ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｒｅ—　ｓｅａｒｃｈ：Ｒｅｖｉｅｗ　Ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＣＭＬＳ，２００１，５８（１２）：１９２３—１９４２．　［３］顾群，孙脊峰。余春艳。等．尖锐湿疣和寻常疣患者外周血Ｔ细胞亚　群及细胞因子水平的检测［Ｊ］．细胞与分子免疫学杂志，２００１，１７　（４）：３９７．　［４］陈春莲，彭俊。余敏君，等．ＧＦＰ—ＨＰＶ１８　Ｅ２删除突变体融合蛋白　真核表达载体的构建与鉴定［刀．南华大学学报（医学版）。２００７。３５　（５）：６４３—６４５．　［５］ＬＩ　Ｙ　Ｈ，ＢＲＡＵＮＥＲ　Ａ，／ＯＮＳＳＯＮ　Ｂ，ｅｔ　ａ１．Ｕｒｅａｐ｜ａｓｍａ　ｔｌｒｅ—　ａｌｙｔｉｃｕｍ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ｂｙ　Ｍａｃｒｏｐｈ　ｇｅｓ［Ｊ］．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，４８（１）：ｌ１４一ｌ１９．　［６］ＧＯＯＤＷＩＮ　Ｅ　Ｃ。Ｄ１ＭＡＩＯ　Ｄ．Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ＨｅＬａ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｃａｕｓｅｓ　ｔｈｅ　ｏｒｄｅｒｌｙ　ｒｅ—　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｏｒｍａｎｔ　ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２０００，９７（２３）：１２５１３—１２５１８．　［７１　ＢＬＡＣＨＯＮ　Ｓ，ＢＥＬＬＡＮＧＥＲ　Ｓ，ＤＥＭＥＲＥＴ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｎｕｃｌｅｏ—ｃｙｔｏ—　ｐｌａｓｍｉｃ　ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｒｉｓｋ　ｈｕｍａｎ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　Ｅ２　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ．１．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００５，２８０（４３）：３６０８８—３６０９８．　（Ｓｔ稿日期：２ｏｏ７一ｏ７一ｏ６）　［责任编辑王慧瑾邓德灵］　・１１８９・