TAT-p38(AF)融合肽的构建及其对紫外线诱导的p38 MAPK通路激活的抑制作用

2024-07-29 作者:

山东医药２０１０年第５Ｏ卷第１９期　ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）融合肽的构建及其对紫外线　诱导的ｐ３８　ＭＡＰＫ通　路激活的抑制作用　张秀娟　，刘亚伟　，王娟　，邓鹏　，姜勇　（１广东医学院，广东湛江５２４０２３；２南方医科大学广东省　功能蛋白质组学重点实验室）　摘要：目的构建ＴＡＴ蛋白转导域介导的０３８（ＡＦ）ＭＡＰＫ蛋白转导系统，研究该蛋白转导系统对紫外线刺激　引起的０３８通路激活作用的影响。方法　将ｐ３８无活性突变体０３ｓ（ＡＦ）亚克隆至含有ＴＡＴ蛋白转导域的ｐＥＴ一　１４ｂ—ＴＡＴ质粒，原核表达、纯化Ｈｉｓ—ＴＡＴ一３８（ＡＦ）融合蛋白。激酶实验检测Ｈｉ０ｓ—ＴＡＴ一３８（ＡＦ）自身磷酸化作用。将　０该蛋白与ＮＨＩ／３Ｔ３细胞孵育，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测该蛋白的蛋白转导功能；紫外线照射后，检测内源性０３８及其底物　ＡＴＦ２的磷酸化水平。结果酶切、测序表明质粒构建正确；目的蛋白被正确表达；Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）融合蛋白无自　身磷酸化作用；Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）蛋白以浓度依赖性方式高效转导人细胞；Ｈｉｓ—ＴＡＴ一３８（ＡＦ）的导入抑制紫外线诱　０导的内源性０３８及其底物ＡＴＦ２的磷酸化。结论ＴＡＴ蛋白转运系统能高效转导外源蛋白进入真核细胞；０３８无活　性突变体ＴＡＴ一３８（ＡＦ）抑制紫外线诱导的００３８　ＭＡＰＫ通路的激活。　关键词：０３８丝裂原活化蛋白激酶；紫外线；蛋白转导域　中图分类号：Ｑ２９１　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１０）１９－００１９－０３　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）ｏｎ　ＵＶ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ３８　ＭＡＰＫ　ｐａｔｈｗａｙ　ＺＨＡＮＧ　Ｘｉｕ－］ｕａｎｌ　ＵＵ　Ｙａ—ｗｅｉ。ＷＡＮＧ　Ｊｕａｎ．ＤＥＮＧ　Ｐｅｎｇ，ＪＩＡＮＧ　Ｙｏｎｇ　（１　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ　５２４０２３，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｉｎａｃｔｉｖｅ　０３８　ｍｕｔａｎｔ（ＡＦ）ＭＡＰＫ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒａｎｓｄｕｅｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ＴＡＴ　ＰＴＤ　ａｎｄ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｃｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒａｎｓｄｕｅｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｎ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ｒａｙ（ＵＶ）一ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　３８０　ＭＡＰＫ　ｐａｔｈｗａｙ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　０３８（ＡＦ）ｗａｓ　ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＥＴ一１４ｂ—ＴＡＴ　ｐｌｓｍｉａｄ．Ｈｉｓ・　一ｐ３８（ＡＦ）ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｌ—　ｌｆｅｄ．Ｋｉｎａｓｅ　ａｓｓａｙ　Ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｉｓ－ＴＪ　一ｐ３８（ＡＦ）ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒａｎｓ—　ｄｕｃｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｗａｓ　ｄｅｔｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＮＩＩ－Ｉ／３Ｔ３　ｃｅｉｌｓ；ｔｈｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｐ３８　ＭＡＰＫ　ａｎｄ　ＡＴＦ２　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　Ｗａｓ　ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒ－　ｅｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．Ｈｉｓ—ＴＡＴ－ｐ３８（ＡＦ）ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｓ　ｎＷａｓ　ｎｏｔ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ．Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｓ　ｅｎｔｎｅｒｄ　ＮＩｅＨ／３Ｔ３　ｃｅｌｌｓ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｉｎ　ａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｓ一Ｈ　ｒＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）　ｐｒｏｔｅｉｓ　ｉｎｎｔｏ　ＮＩＨ／３Ｔ３　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ＵＶ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　０３８　ＭＡＰＫ　ａｎｄ　ＡＴＦ２．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒａｎｓｄｕｅｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ＴＡＴ　ＰＴＤ　Ｃａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｔｈｅ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｅ　ｃｅｉｌｓ．　ＴＡＴ一３８（ＡＦ）ｆ０ｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｃａｎ　ｐａｒｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ＵＶ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　３８　ＭＡＰＫ　０ｐａｔｈｗａｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：０３８　ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ；ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ｒａｙ；ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒｎｓｄｕｅｔａｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ　ｐ３８　ＭＡＰＫ作为丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）　家族的重要成员，在炎症、应激反应、细胞存活、分化　和凋亡等过程中具有重要作用，被认为是众多细胞　信号转导的中转站¨　ｊ。紫外线等应激刺激能激活　应激调节的ＭＡＰＫ蛋白激酶级联。Ｉ型人免疫缺陷　多肽片段“ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ”有关，该片段为ＴＡＴ　的蛋白转导域（ＰＴＤ）。ＴＡＴ　ＰＴＤ能够携带蛋白质、　ＤＮＡ等大分子物质进入细胞，是一种很有前途的运　载工具　－５］。２００８年９月～２００９年３月，我们以　ＴＡＴ　ＰＴＤ为载体，将小鼠ｐ３８及其双磷酸化位点突　病毒反式激活因子（ＨＩＶ一１　ＴＡＴ）能通过细胞膜进人　细胞，ＴＡＴ通过细胞膜的转导功能与ＴＡＴ分子中的　基金项目：国家自然科学基金面上项目（３０５７２１５１）。　・通讯作者　变的无活性突变体ｐ３８（ＡＦ）转导人小鼠成纤维细　胞ＮＨＩ／３Ｔ３，研究外源性ｐ３８及其无活性突变体的　导人对紫外线照射诱导的ｐ３８　ＭＡＰＫ通路激活的影　响，以探讨利用ＴＡＴ蛋白导人外源蛋白调节细胞信　号通路或治疗疾病的可行性。　１　９　山东医药２０１０年第５Ｏ卷第１９期　１材料与方法　１．１材料凝胶图像分析仪；ＰＣＲ仪；半干电转移　外线刺激，其余处理同实验组。用上述方法收集细　胞裂解上清，Ｗｅｓｔｅｍ　ｂｌｏｔ法检测内源性ｐ３８及其底　物ＡＴＦ２的磷酸化水平，一抗为兔抗磷酸化ｐ３８抗　仪；Ｉｍａｇｅ　Ｓｔａｔｉｏｎ　２０００Ｒ图像工作站；限制性核酸内切　酶；小鼠抗Ｈｉｓ标签抗体、兔抗磷酸化ｐ３８抗体、兔抗　体、兔抗ＡＴＦ２抗体和兔抗ａｃｔｉｎ抗体，二抗为ＨＲＰ　磷酸化ＡＴＦ２抗体和鼠抗ａｃｔｉｎ抗体、辣根过氧化酶　偶联的抗兔ＩｇＧ抗体。　（ＨＲＰ）标记的马抗小鼠ＩｇＧ抗体。质粒及ＮＩＨ／３Ｔ３　２结果　细胞由广东省功能蛋白质组学重点实验室提供。　１．２方法　１．２．１　ｐＥＴ．１４ｂ—ＴＡＴ．ｐ３８（ＡＦ）质粒的构建　用　ＢａｍＨ　Ｉ和Ｎｄｅ　Ｉ限制性内切酶对ｐＥＴ一１４ｂ—ＴＡＴ—ｐ３８　及ｐＤｓＲｅｄ．Ｎ１一ｐ３８（ＡＦ，１８０位Ｔｈｒ突变为Ａｌａ，１８２　位Ｔｒｙ突变为Ｐｈｅ的小鼠ｐ３８突变体）质粒分别酶　切，ＤＮＡ连接酶连接酶切产物，质粒命名为ｐＥＴ一　１４ｂ一　ｒ—ｐ３８（ＡＦ）。酶切、测序鉴定质粒正确性。　１．２．２　Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）融合蛋白的表达及纯化　将重组质粒转化大肠杆菌ＢＩ２１（ＤＥ，），ＬＢ培养　基培养菌落。取菌液沉淀，Ｎｉ“一ＮＴＡ亲和树脂层析　纯化蛋白，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳鉴定目的蛋白大小。Ｈｉｓ—　ＴＡＴ—ｐ３８蛋白和对照蛋白Ｈｉｓ一　ｒＡＴ—ＥＧＦＰ、Ｈｉｓ—ｐ３８　表达、纯化方法同上。　１．２．３　Ｈｉｓ．ＴＡＴ．ｐ３８及其突变体自身磷酸化检测　激酶实验：Ｈｉｓ。ＴＡＴ—ｐ３８、Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）蛋白、　ＡＴＰ加人激酶缓冲液中，３７℃反应３０　ｍｉｎ，空白对　照组只加ＡＴＰ和激酶缓冲液。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测　Ｈｉｓ．ＴＡＴ—ｐ３８及其突变体自身磷酸化效应，一抗为　兔抗磷酸化ｐ３８抗体。　１．２．４　ＴＡＴ介导的融合蛋白转导试验于ＮＩＩ－Ｉ／　３Ｔ３细胞８０％融合时进行：Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）、Ｈｉｓ—　ＴＡＴ．ｐ３８、Ｈｉｓ—ｐ３８及Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ＥＧＦＰ蛋白分别以１　ｐ，ｍｏｌ／Ｌ的终浓度加人培养基培养３　ｈ。Ｈｉｓ一　ｒＡＴ—　ｐ３８（ＡＦ）蛋白按０、０．５、１、１．５、２、２．５￣ｔｍｏｌ／Ｌ终浓　度加入培养基培养３　ｈ。收集、裂解细胞，离心取上　清，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测融合蛋白人胞效应，一抗为　小鼠抗Ｈｉｓ标签抗体。　１．２．５　Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ｐ３８及其突变体Ｈｉｓ—ＴＡＴ－ｐ３８（ＡＦ）　蛋白转导人胞对紫外线诱导的ｐ３８　ＭＡＰＫ通路激活　的影响将ＮＩＩ－Ｉ／３Ｔ３细胞接种于６　ａｍ皿中，待细　胞长至８０％融合时进行蛋白转导实验。实验分为８　组：第１、２组不加外源蛋白；第３、４组加人ｌ　ｔｘｍｏｌ／Ｌ　Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ＥＧＦＰ蛋白；第５、６组加１　ｉｘｍｏｌ／Ｌ　Ｈｉｓ—ＴＡＴ—　ｐ３８（ＡＦ）蛋白；第７、８组加１　ｉｘｍｏｌ／Ｌ　Ｈｉｓ—ＴＡＴ－ｐ３８　蛋白。继续培养３　ｈ后，弃９０％培养基，２、４、６、８组　（实验组）用４０　Ｊ／ｍ　中波紫外线照射９０　Ｓ（紫外线　照射用ＹＫ一３４ＵＶ型紫外辐照仪进行定量），加回原　培养基，继续培养１　ｈ。１、３、５、７组（对照组）不加紫　２０　２．１　ｐＥＴ一１４ｂ－ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）质粒的鉴定ｐＥＴ一　１４ｂ—ＴＡＴ．ｐ３８（ＡＦ）质粒酶切后ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳，可　见约１．１　ｋｂ的ｐ３８（ＡＦ）目的条带，符合预期结果。　测序结果证实质粒构建正确。　融合蛋白的表达和纯化蛋白表达、纯化后　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，可见４１　ｋＤ左右处Ｈｉｓ－ＴＡＴ—ｐ３８和　Ｈｉｓ．ＴＡＴ．ｐ３８（ＡＦ）目的蛋白，４０　ｋＤ处Ｈｉｓ—ｐ３８蛋白　及３４　ｋＤ的Ｈｉｓ－ＴＡＴ—ＥＧＦＰ蛋白（图１）。　｜　ｌｌ　ｌ　０＿　｜　＇＇ｌ＇　＿ｊ　ｌ＿　－　＇　２　ｌｌｌ０００—　图１　Ｈｉｓ－ＴＡＴ－ｐ３８（ＡＦ）、Ｈｉｓ－ＴＡＴ—ｐ３８、Ｈｉｓ—ｐ３８　及Ｈｉｓ－ＴＡＴ．ＥＧＦＰ蛋白表达及纯化　注：Ｍ：蛋白标记；１，２：Ｈｉｓ・ＴＡＴ－ｐ３８（ＡＦ）；３，４：Ｈｉｓ－ＴＡＴ—ｐ３８；　６：Ｈｉｓ—ｐ３８；７：Ｈｉｓ－ＴＡＴ—ＥＧＦＰ　　Ｈｉｓ．ＴＡＴ—ｐ３８、Ｈｉｓ．　一ｐ３８（ＡＦ）体外自身磷酸　化效应的检测　激酶试验可见，Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ｐ３８可被　检测到，而双磷酸化位点突变的Ｈｉｓ－ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）　蛋白不能被检测到（图２）。　ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ￣　Ｈｉ＃＿Ｔ＾Ｔ　糟　・　－　ＨＩｓ－ＴＡＴ－ｔ￣８（ＡＦ｜－　＋　图２　Ｈｉｓ－ＴＡＴ－ｐ３８、Ｈｉｓ—ＴＡＴ－０３８（Ａｔ）蛋白体外自身　磷酸化效应　２．４　ＴＡＴ介导的融合蛋白蛋白转导　可见Ｈｉｓ—　ＴＡＴ—ＥＧＦＰ、Ｈｉｓ—ＴＡＴ．ｐ３８（ＡＦ）及Ｈｉｓ．ＴＡＴ—ｐ３８蛋白　均可进人细胞，而Ｈｉｓ．ｐ３８则不能进入细胞，说明　ＴＡＴ能够介导与其融合的外源蛋白人胞（图３）；在　￣ｍｏｌ／Ｌ范围内，Ｈｉｓ－ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）蛋白以　浓度依赖的方式转导入细胞。　　ＴＡＴ介导ｐ３８及其突变体蛋白转导人胞对紫　外线诱导的ｐ３８　ＭＡＰＫ通路激活的影响与对照组　２．２５，２．３０．５—２．５　Ｉ２．５山东医药２０１０年第５Ｏ卷第１９期　相比，实验组ＮＩＨ／３Ｔ３细胞内源性ｐ３８及ＡＴＦ２的　肽模块Ｔ—Ｘａａ—Ｙ，ｐ３８亚族的所有成员都具有“Ｔ—Ｇ—　磷酸化水平均增强。与未导入任何外源蛋白的紫外　线刺激组及导人无关蛋白Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ＥＧＦＰ的紫外线　刺激组相比，在同等紫外线刺激条件下，导人相同浓　度ｐ３８突变体Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）蛋白后，内源性　ｐ３８及ＡＴＦ２磷酸化水平明显降低，而导人野生型　Ｈｉｓ一　ＩＩＡＴ．ｐ３８蛋白后，内源性ＡＴＦ２磷酸化水平则明　显增加（图４）。　ａａ　图３　ＴＡＴ介导融合蛋白进入ＮＩＨ／３Ｔ３细胞　注：１为空白细胞裂解上清；２…４　６　８分别为Ｈｉｓ—ＴＡＴ．ＥＧＦＰ、Ｈｉｓ　ｐ３８、Ｈｉｓ－ＴＡＴ—ｐ３８、Ｈｉｓ一　ｒＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）蛋白；３…５　７　９分别为与Ｈｉｓ—　ＴＡＴ—ＥＧＦＰ、Ｈｉｓ—ｐ３８、Ｈｉｓ－ＴＡＴ—ｐ３８、Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）蛋白孵育后的细　胞裂解上清　ｐ　８　砷ｏｓ…　Ｗ　ｌ・礴　Ｉ．｝摹　∞Ｉ＾ＦＩ　ＨＩｔ　盯鼍ＯＦＰ　图４　Ｈｉｓ－ＴＡＴ－ｐ３８【ＡＦ）蛋自转导入胞抑制紫外线诱导的　内源性ｐ３８及ＡＴＦ２磷酸化作用　３讨论　一直以来，肽类药物导人细胞受限于细胞膜屏　障的阻挡。近年来发展起来的蛋白转导系统为这些　物质快速、高效地进人细胞内提供了有力的工具。　以Ａｎｔｐ、ＨＩＶ　ＴＡＴ、ＶＰ２２为代表的被称为ＰＴＤ，亦称　“细胞穿透肽”，被证实不仅自身能够穿过细胞膜，　且能在体内、体外有效地转运生物活性蛋白人胞。　ＴＡＴ　ＰＴＤ由１１个氨基酸组成，却能携带蛋白质、多　肽、ＤＮＡ分子甚至磁性纳米粒子等进人几乎所有的　细胞和组织，甚至可通过血脑屏障，具有转导效率　高、对细胞损伤小的特点。ＴＡＴ　ＰＴＤ被认为是一种　很有前途的运载工具，在基础医学研究和临床治疗　方面应用前景广阔　Ｊ。　紫外线照射、热休克、高渗、致炎细胞因子等都能　激活ｐ３８　ＭＡＰＫ通路　。ＭＡＰＫ的激活，需要双位　点，即苏氨酸（Ｔ）和酪氨酸（Ｙ）同时被磷酸化。这两　个邻近的磷酸化位点之间被一个氨基酸分开，形成三　Ｙ”双位点磷酸化模块　，ｐ３８被磷酸化激活后移位入　核或转移到其他部位，磷酸化ＡＴＦ２、ＣＨＯＰ１０、ＰＲＡＫ　等转录因子或细胞骨架相关蛋白、酶类等多种底物来　调节多种细胞生理、病理过程　Ｊ。　基于ＴＡＴ　ＰＴＤ强大、高效的携带大分子物质进　入细胞能力，本实验将双磷酸化位点突变的ｐ３８　（ＡＦ）亚克隆至原核表达质粒，原核表达和纯化Ｈｉｓ．　ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）融合蛋白蛋白，观察ＴＡＴ　ＰＴＤ介导的　蛋白人胞效应及其对紫外线刺激引起的ＮＨＩ／３Ｔ３　细胞ｐ３８　ＭＡＰＫ通路激活的影响。本实验结果表　明，双磷酸化位点突变的Ｈｉｓ．ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）蛋白不　具有自身磷酸化功能，为ｐ３８无活性突变体；ＴＡＴ可　介导融合蛋白以浓度依赖性方式转导进人细胞；　Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）蛋白的导人可竞争性抑制紫外线　刺激引起的内源性ｐ３８磷酸化作用，并抑制ｐ３８下　游底物ＡＴＦ２的磷酸化，而野生型Ｈｉｓ．ＴＡＴ—ｐ３８蛋白　的导入则使ＡＴＦ２磷酸化水平加强。本研究证实　ＴＡＴ蛋白转运系统能够高效转导蛋白进入真核细　胞；Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ｐ３８（ＡＦ）蛋白可能通过竞争性地与内　源性ｐ３８的上游激酶或下游底物ＡＴＦ２结合，从而　抑制紫外线刺激引起的内源性ｐ３８及ＡＴＦ２激活。　本研究对于利用ＴＡＴ介导的外源蛋白导人研究细　胞信号通路或治疗疾病具有重要意义。　参考文献：　［１］Ｃｏｕｌｔｈａｒｄ　ＬＲ，Ｗｈｉｔｅ　ＤＥ，Ｊｏｎｅｓ　ＤＬ，ｅｔ　ａ１．ｐ３８（ＭＡＰＫ）：ｓｔｒｅｓｓ　ｍｓｐｅｎ￣ｓ　ｆｒｏｍ　ｍｏｌｅｅｕｌ￣ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｔｏ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｍｏｌ　Ｍｅｄ，２００９，１５（８）：３６９－３７９．　［２］Ｃｕｅｎｄａ　Ａ，Ｒｏｕｓｓｅａｕ　Ｓ．ｐ３８　ＭＡＰ—ｋｉｎａｓｅｓ　ｐａｔｈｗａｙ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ，　２００７，１７７３（８）：１３５８—１３７５．　［３］Ｓｎｙｄｅｒ　ＥＬ，Ｄｏｗｄｙ　ＳＦ．Ｃｅｌｌ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　［Ｊ］．Ｐｈａｒｍ　Ｒｅｓ，２００４，２１（３）：３８９－３９３．　［４］Ａｓａｌ　Ｄ，Ｋｅｄａｍａ　ＫＢ，ｓｈｏｊｉ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｙｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　ａｎ　ＨＩＶ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｓｉｇｎ８ｌ［Ｊ］．Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ，２００８，４（４）：　３８６－３９１．　［５］Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　Ｍ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　Ｍ，Ｙｏｓｈｉｎｏ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｓ　Ｐｈａｓｅ—ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｃｒｅ－・ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｂｙ　ＨＩＶ－ＴＡＴ・・ＰＴＤ－－　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｅｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００８，１４３（１）：８７—　９５．　［６］Ｃｈｉｎ　Ｌｅｅ　ＳＨ，Ｊｅｆｅｉｆｅｓ　Ｒ，Ｗａｔｔ　Ｐ，ｃｔ　ａ１．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆｔｈｅ　ＴＡＴ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒａｎｓｄｕｅｔｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ　８ｓ　ａ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｖｅｈｉｃｌｅ　ｉｎ　ｐｉｎｔｏ－　ｐａｒａｓｉｔｓｅ［Ｊ］．Ｅｘｐ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ，２００８，１１８（３）：３０３－３０７．　［７］Ｓｈｉｍ　ＪＳ，Ｋｗｏｎ　ＹＹ，Ｈａｎ　ＹＳ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｅｃｔ　ｏｆｐａｎｄｕｒａｔｉｎ　Ａ　ｏｎ　ＵＶ－－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｔｏｇｅｎ・・ａｃｔｉｖａｔｄｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ　（ＭＡＰＫｓ）ｉｎ　ｄｅｒｍａｌ　ｆｉｂｒｕｂｌ￣ｔ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ　Ｍｅｄ，２００８，７４　（１２）：１４４６－１４５０．　［８］Ｏｗｅｎｓ　ＤＭ，Ｋｅｙｓｅ　ＳＭ．Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＡＰ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｉｇｎａｌ—　ｌｉｎｇ　ｂｙ　ｄｕａｌ—ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００７，　２６（２ｚ）：３２０３－３２１３．　［９］Ｏｎｏ　Ｋ，Ｈａｎ　Ｊ．Ｔｈｅ　ｐ３８　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｅｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ：ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｎａｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌ，２０００，１２（１）：１－１３．　（收稿日期：２００９—１１．１５）　２１