繁殖候选基因Lhx8的真核表达和定位分析

2024-07-29 作者:

上海农业学报２０１４，３０（１）：５—８　Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　文章编号：１０００．３９２４（２【Ｊ１４）０１．００５—０４　繁殖候选基因Ｌｈｘ８的真核表达和定位分析　王晶晶　，潘雪男　，何晓芳　，毛　慧　，王荣谈　（　上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海２０１１０６；　上海瑞丰农业科技有限公司，上海２０１１０６）　摘要：从猪卵巢组织中提取总ＲＮＡ为模板，采用ＲＴ—ＰＣＲ方法获得了猪Ｌｈｘ８基因的完整开放阅读框，　将该基因克隆到真核表达载体ｐＥＧＦＰ—Ｎ１中，经酶切分析和测序证明成功构建了真核重组质粒ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一　Ｌｈｘ８。将成功构建的ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一Ｌｈｘ８分别转染猪肾细胞ＰＫ　１５和猪颗粒细胞（ＧＣｓ），转染后４８　ｈ，通过荧光　显微镜观察对猪Ｌｈｘ８基因在这２种细胞中的定位特点进行分析。结果显示：绿色荧光呈点状分布，根据绿色荧　光分布的位置，推测Ｌｈｘ８蛋白很可能位于细胞核中。　关键词：猪；Ｌｈｘ８基因；真核表达；定位分析　中图分类号：Ｓ８１３．３　文献标识码：Ａ　Ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｇｅｎｅ　Ｌｈｘ８　ＷＡＮＧ　Ｊｉｎｇ—ｊｉｎｇ　，ＰＡＮ　Ｘｕｅ－ｎａｎ　，ＨＥ　Ｘｉａｏ—ｆａｎｇ　，ＭＡＯ　Ｈｕｉ　，ＷＡＮＧ　Ｒｏｎｇ－ｔａｎ　（　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０　１　１　０６，Ｃｈｉｎａ；。Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｒｕｉｆｅｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０１　１０６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｏｖａｒｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａ　ｔｅｍｐｌｅｔ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｕｌｌ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ（０ＲＦ）ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　Ｌｈｘ　８　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ＲＴ．ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ｆｕｌｌ　０ＲＦ　ｏｆ　Ｌｈｘ　８　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＥＧＦＰ．Ｎ１　ｖｅｃｔｏｒ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＰＥＧＦＰ—Ｎ１．Ｌｈ　８　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ＰＫ．１５　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｇｒａｎｕｌｏｓａ　ｃｅｌｌｓ（ＧＣｓ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｔ　４８　ｈ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．ｔｈｅ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｈｘ８　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｖ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｓｓｕｍｅｄ　ｓｐｏｔ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ｔｈｅ　Ｌｈｘ８　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｐｒｏｂａｂｌｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｕｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｌｈｘ　８　ｇｅｎｅ；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｌｈｘ８是ＬＩＭ同源盒基因家族中的一员，又称Ｌ３，含有２个保守的功能结构域——ＬＩＭ结构域和同　源结构域，可能通过蛋白－蛋白之间的相互作用和转录调控参与细胞分化和器官发育等重要生理过程　］。　通过氨基酸多序列比对分析发现，人Ｌｈｘ８基因与鼠Ｌｈｘ８基因所编码的蛋白质序列相似性高达８０％＿２］。　Ｌｈｘ８基因最早报道与小鼠的腭裂密切相关ｌ＿３］，但之后的研究发现，Ｌｈｘ８基因是ＬＩＭ同源盒基因家　族中第一个在性腺组织表达的基因，在生殖细胞中具有较高的表达，与卵母细胞特异性表达调控因子有　密切的关系，对动物的卵巢发育和机能维持发挥着关键调控作用　一７３。研究表明：Ｌｈｘ８在小鼠上的表达　开始很早，在１３．５　ｄ的小鼠胚胎中就可检测到Ｌｈｘ８［ｓ］。在成年小鼠卵巢中，Ｌｈｘ８在原始卵泡、初级卵泡　以及窦状卵泡中均有表达。将Ｌｈｘ８基因敲除后，发现成年雌性小鼠的卵巢中缺乏生殖细胞，卵母细胞数　量大大减少，并且卵泡退化　］。Ｃｈｏｉ　Ｙ等　研究发现，敲除Ｌｈｘ８基因后，刚出生的小鼠卵巢与正常小鼠　一样，但组织学分析发现，在基因敲除小鼠的卵巢中，原始卵泡不能保持生长，且不能向生长卵泡转化。　收稿日期：２０１３—０６—２９　作者简介：王晶晶（１９８２一），女，博士，助理研究员，研究方向：猪的遗传育种与繁殖。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｚｙｑ—ｗａｎｇｊｊ＠ｙｅａｈ．ｎｅｔ　＊通讯作者　６　王晶晶，等：繁殖候选基因Ｌｈｘ８的真核表达和定位分析　芯片结果表明：Ｌｈｘ８基因的缺失引起减数分裂关键因子Ｄｍｃ１、Ｍｓｈ５、Ｓｐｏ１１、Ｒｅｃ８、Ｓｙｃｐ３等基因的下　调，导致卵母细胞的分化受阻。此外，敲除Ｌｈｘ８基因后，Ｎｏｂｏｘ、ＧＤＦ９、Ｐｏｕ５ｆｌ、Ｚｐ１、Ｚｐ３等卵母细胞　特异性基因在卵巢中的表达水平急剧减少或不表达。这说明Ｌｈｘ８基因在卵子发生的早期阶段对于卵母　细胞的分化和存活至关重要。Ｚｈａｎｇ等　研究发现，Ｌｈｘ８的表达与小鼠原始卵泡的激活密切相关。Ｌｉｍ　等　综述对维持原始卵泡存活发挥重要作用的转录因子时也重点提到了Ｌｈｘ８基因。当利用马利兰和环　磷酰胺进行化学疗法时，发现Ｌｈｘ８等基因的表达显著下降，卵巢生殖细胞减少，增加了卵巢功能早衰的　危险　。　２００９年，Ｆａｎｇ等　克隆了猪的Ｌｈｘ８基因，并发现Ｌｈｘ８基因在性腺、脑组织、免疫组织和骨骼肌中　表达，推测Ｌｈｘ８是影响猪繁殖性状的一个重要候选基因。通过生物信息学预测猪的Ｌｈｘ８蛋白定位于　细胞核中。本研究通过试验对Ｌｈｘ８蛋白的定位进行了初步的验证分析，以期为进一步研究猪Ｌｈｘ８基　因的功能奠定基础。　１　材料与方法　１．１菌株、载体及试剂　Ｔｒｉｚｏｌ、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ　２０００、无内毒质粒提取试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，Ｍ－ＭＬＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｏｌｉｇｏ　ｄＴ、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ、ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，ｐＥＧＦＰ－Ｎ　１、限制性内切酶　Ｘｈｏ　Ｉ和ＢａｍＨＩ、Ｔ４　ＤＮＡ连接酶购自Ｔａｋａｒａ公司，ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ、ＬＡ　Ｔａｑ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、ＴＯＰＩＯ感　受态细胞、ＤＮＡ纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自南京天根生物技术有限公司，ＤＭＥＭ／Ｆ１　２培养液、胰　酶购自ＧＩＢＣＯ公司，其他常用试剂均为国产分析纯。　１．２引物设计与合成　根据ＧｅｎＢａｎｋ中公布的猪Ｌｈｘ８基因的序列，利用Ｐｒｉｍｅｒ　５软件分别设计扩增部分ｃＤＮＡ（Ｌｈｘ８一　Ｆ／Ｒ）和ＯＲＦ（用于构建真核表达载体，Ｌｈｘ８一Ｎ１．Ｆ／Ｒ）的引物，引物由上海英俊公司合成，序列见表１。　表１用于扩增Ｌｈｘ８基因的引物序列　Ｔａｂｌｅ　ｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　Ｌｈｘ８　ｇｅｎｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　１．３　Ｌｈｘ８基因的扩增及测序　采集猪的卵巢组织，根据Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司提供的ＲＮＡ提取方法，利用Ｔｒｉｚｏｌ提取总ＲＮＡ。依据　Ｐｒｏｍｅｇａ公司的反转录方法合成ｃＤＮＡ。利用引物Ｌｈｘ８一Ｆ／Ｒ扩增Ｌｈｘ８的ｃＤＮＡ，ＰＣＲ反应体系：　ｃＤＮＡ　１　ＦＬ，２×ＬＡ　Ｂｕｆｆｅｒ　２５　ＦＬ，２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ　４　Ｌ，ＬＡ　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶０．５／＊Ｌ，１０／￣ｍｏｌ／Ｌ　上下游引物各１　ＦＬ，ｄｄＨ　Ｏ补齐５０　ＦＬ。反应程序：９４℃３　ｍｉｎ；９４℃３０　Ｓ、５８℃３０　Ｓ、７２℃７０　Ｓ，３５　个循环；最后７２℃７　ｍｉｎ。ＰＣＲ结束后，取５　Ｌ产物，用１．０％琼脂糖凝胶电泳检测。　１．４真核表达质粒的构建、鉴定及提取　以１．３中获得的ＰＣＲ产物为模板，利用Ｌｈｘ８．Ｎ１．Ｆ／Ｒ引物，扩增Ｌｈｘ８完整的ＯＲＦ，获得８８８　ｂｐ的　ＤＮＡ片段，回收后将ＤＮＡ片段和ｐＥＧＦＰ．ＮＩ经Ｘｈｏ　Ｉ和ＢａｒｎＨＩ双酶切后再回收，利用Ｔ４　ＤＮＡ连接　酶将ＤＮＡ片段和线性ｐＥＧＦＰ．Ｎ１连接，然后转化于ＴＯＰ１０感受态，采用氨苄抗性筛选获得的质粒经双　酶切鉴定后，将阳性质粒命名为ｐＥＧＦＰ．Ｎ１．Ｌｈｘ８并进行测序。利用无内毒质粒提取试剂盒提取　ｐＥＧＦＰ．Ｎ１．Ｌｈｘ８，测定质粒浓度后于一８Ｏ℃保存备用。　１．５细胞培养、转染及观察　采新鲜猪卵巢，抽取卵泡中的颗粒细胞（ＯＣｓ），用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）清洗２次，用含１（）％胎牛血清　的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液在３７℃、５％ＣＯ：培养箱内培养，利用０．２５％胰酶消化传代［１　。猪肾细胞（ＰＫ．　１　５）的培养条件与ＧＣｓ相同。将ＧＣｓ和ＰＫ一１　５分别接种于６孔板，设空白组、阴性对照组、ｐＥＧＦＰ—Ｎ１．　Ｌｈｘ８转染组，待细胞达到８０％～９Ｏ％融合时，按Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００试剂说明进行转染，４８　ｈ后在荧　光显微镜下观察。