HPV18E2蛋白CTL表位多肽的构建与表达

2024-07-29 作者:

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局解手术学杂志３７６　２００７年第１６卷第６期　Ｊ　Ｒｅｇｉ　ｏｎａｌ　Ａｎａｔ＆Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ　Ｓｕｒｇ，２００７，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．６　ＨＰＶ１８Ｅ２蛋白ＣＴＬ表位多肽的构建与表达　汪　云　，肖　岚　，吕凤林　（１．第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室，重庆４０００３８；２．第三军医大学附属大坪　医院野战外科研究所第一研究室，重庆４０００４２）　［摘要］　目的分析ＨＰＶ１８Ｅ２蛋白的ＣＴＬ表位，合成并纯化这些表位多肽，构建表达ＨＰＶ１８Ｅ２蛋白的靶细胞，检验特异性　ＣＴＬ对靶细胞的杀伤效果，为进一步研制人乳头瘤病毒１８型（ＨＰＶ１８）基因工程疫苗打下基础。方法　以重组质粒（ｐＢＲ３２２．　ＨＰＶ１８）为模板，利用ＰＣＲ方法扩增ＨＰＶ１８Ｅ２　ＤＮＡ片段，将ＨＰＶ１８Ｅ２　ＤＮＡ与加强绿色荧光质粒（ｐＩＲＥＳ：　ＥＧＦＰ）重组构建重组质　粒（ｐＩＰＥＳ：－ＨＰＶ１８Ｅ２一ＥＧＦＰ）。用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性。重组质粒转染Ｈｅｌａ细胞。　ｃｒ释放实验评估ＣＴＬ　杀伤能力。结果８Ｏ．００％。结论克隆重组质粒ｐＩＲＥＳ：－ＨＰＶ１８Ｅ２一ＥＧＦＰ酶切后显示的酶切图谱与预期相同，而且测序验证插入片段全序列无改　三条备选肽段都具有明显的杀伤效应，均为ＨＰＶ１８Ｅ２蛋白的有效ＣＴＬ表位。　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１６７２－５０４２（２００７）０６－０３７６－０３　变。转染并用Ｇ４１８筛选后，在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达。三条候选多肽特异性杀伤能力分别为６０．００％、７１．２９％和　［关键词］人乳头瘤病毒１８型；Ｅ２基因；多肽　［中图分类号］Ｑ７８４；Ｒ７３７．３３　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｌＲＥＳ２－ＨＰＶ１　８－ＥＧＦＰ　ＷＡＮＧ　Ｙｕｎ，ＸＩＡＯ　Ｌａｎ，Ｌ０　Ｆｅｎｇ－ｌｉｎ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４０００３８，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ａｎａｌｙｓｅ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｐｉｔｏｐｅ－ｓｐｅｅｉｉｆｅｌａ　ＨＰＶ１８Ｅ２　ＣＴＬ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　Ｅ２　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ＨＰＶ１８　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ｆｒｏｍ　ｐＢＲ３２２－ＨＰＶ１８　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐｌＲＥＳ２－ＥＧＦＰ．Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ　ＨＰＶ１８Ｅ２　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅｎ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ＨｅＬａ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｓ　ｖａｌｕｅｄ　ｂｙ”Ｃｒ－ｒｅｌｅａｓｅ　ａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＨＰＶ１８　Ｅ２　ｇｅｎｅ　ｆｒａｇ－　ｍｅｎｔ　Ｗａｓ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｌｉｇａｔｅｄ　ｔｏ　ｐｌＲＥＳ２－ＥＧＦＰ，ｔｈｅｎ　ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ＨｅＬａ　ｃｅｌｌｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｃｅｌｌｓ　Ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｗａｓ　６０．００％．７１．２９％ａｎｄ　８Ｏ．００％．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｈａｖｅ　ｔｈｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ａｃｔｉｖｅ　ｅｐｉｔｏｐｅ－ｓｐｅｅｉｆｉｃａｌ　ＣＴＬ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅｍ，ａ　ｎｅｗ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｍａｙｂｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃ－　ｔｅｄ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅｌ　８；Ｅ２　ｇｅｎｅ；ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。宫颈癌的发生　可能与性生活紊乱，过早性生活，早年分娩，多产，地理　环境等因素有关。分子生物学研究结果显示９０％以　上的宫颈癌伴有人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）感染。官颈癌　１材料与方法　１．１材料　菌株：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５（由本实验室保存）。质粒：①ｐＢＲ３２２／　ＨＰＶ１８，含目的基因的重组质粒，由德国癌症研究中心Ｅ．Ｍ　ｄｅ　以鳞状细胞癌最为多见，其次为腺癌和腺鳞癌等。高　危型ＨＰＶ的感染是诱发官颈癌的必要条件，尤其是　ＨＰＶ１６型和ｌ８型。Ｅ２是一种反式激活蛋白，涉及病　Ｖｉｌｌｉｅｒｓ教授惠赠；￣）ｐＩＲＥＳ：－ＥＧＦＰ：含绿色荧光蛋白报告基因的　真核表达载体，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司，由Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ　Ｒｏｇｅｒ　Ｙ．Ｔｓｉｅｎ（Ｕｎｉ—　ｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ）惠赠，含有Ｋａｎ　抗性基　毒ＤＮＡ转录的反式激活，能延缓染色体有丝分裂的进　程，具有抑制癌细胞生长的功能。本实验是以加强绿　色荧光质粒ｐＩＲＥＳ２一ＥＧＦＰ为载体，构建了ＨＰＶ１８Ｅ２　蛋白的真核表达质粒ｐＩＲＥＳ２一ＨＰＶ１８Ｅ２一ＥＧＦＰ，为制作　官颈上皮内瘤变的治疗性多肽疫苗打下基础。　因。ＨｅＬａ细胞株，购自协和医科大学基础医学研究所。主要　试剂：ｐｆｕ高保真ＤＮＡ聚合酶（上海生物工程公司）；质粒抽提　试剂盒（Ｏｍｅｇａ公司，美国）；ＤＮＡ凝胶回收试剂盒（上海华舜　生物有限公司）；ＢａｍＨ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｉ内切酶（大连ＴａＫａＲａ公司）；　Ｔ　ＤＮＡ连接酶试剂盒（大连ＴａＫａＲａ公司）；ＤＬ２０００　Ｍａｒｋｅｒ（大　连ＴａＫａＲａ公司）；ＤＬ１５０００　Ｍａｒｋｅｒ（大连ＴａＫａＲａ公司）；ＰＣＲ克　隆引物（上海生物工程公司），上游引物：５’・ＣＧＧ丛　ＡＴＧＧＡ　［基金项目］国家自然科学基金资助项目（３０１７０８８４）　［作者简介］汪云（１９８０一），女，四川省成都市人，助教，硕士，主要　ＧＡＣＴＣＴＩＴＧＣＣ　３’；（下划线部分为ＢａｍＨ　Ｉ酶切位点，５’端为　保护性碱基），下游引物５’ＣＧ—ＧＡ—ＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＣＣＧＡＡＧＣ－３’　从事宫颈癌方面的研究。电话：（０２３）６８７５２２２９　（下划线部分为ＥｃｏＲ　Ｉ酶切位点，５’端为保护性碱基）；Ｇｅｎｅ　Ｊａｍｍｅｒ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅ．ａｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公司，美国）；质粒中量抽　［收稿日期］２００７－０８－３０　［修回日期］２００７－１０－１５　维普资讯 维普资讯

局解手术学杂志３７８　２００７年第１６卷第６期　Ｊ　Ｒｅ￣ｏｎａｌ　Ａｎａｔ＆Ｏｏｅｒａｆｉｖｅ　Ｓｕｒｇ，２００７，Ｖｏ１．１６．Ｎｏ．６　ＨＰＶ编码的蛋白。因此，整合常被认为是癌前病变转　变为癌的激活机制之一Ｌ３ｊ。ＨＰＶ中的１６型和１８型　是引发宫颈癌的主要型别。有研究发现ＨＰＶ１８感染　在腺癌及腺鳞癌中更常见　。而且更易发生骨盆淋　的有效ＣＴＬ表位。也为以后宫颈上皮内瘤变的治疗　性多肽疫苗研制打下基础。　［参考文献］　［１］Ａｒｉａｓ　Ｐｕｌｉｄｏ　Ｈ，Ｐｅｙｔｏｎ　ＣＬ。Ｔｏｒｒｅｚ　Ｍａｒｔｉｎｅｚ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏ－　ｍａｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１　８　ｖａｒｉｎｔａ　ｌｉｎｅａｇｅｓ　ｉｎ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ－　巴结转移和间质浸润，复发率也相对较高　ｊ。整合　ＨＰＶ１８基因到宿主细胞后对癌的发生发展起决定性　ｉｚｅｄ　ｂｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＬＣＲ—Ｅ６，Ｅ２，ａｎｄ　Ｌ１　ｒｅｇｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｖｉｍｌｏ－　ｇＹ。２００５，３３８（１）：２２—３４．　作用。其基因编码两种蛋白Ｅ１及Ｅ２。Ｅ２能结合　ＨＰＶ的早期启动子，从而抑制Ｅ６、Ｅ７转录。高危型　ＨＰＶ感染宫颈上皮后，病毒组ＤＮＡ整合到染色体中，　其Ｅ６和Ｅ７基因产物的持续表达，是诱发宫颈癌的主　要原因　Ｊ。因此，Ｅ２失去表达后将导致病毒癌基因的　激活。在ＨＰＶ１８感染的细胞株中Ｅ２处于灭活状态，　Ｅ２的功能即是抑制癌的发展　。将Ｅ２导入ＨＰＶ感　［２］Ｔｈｉｅｒｒｙ　Ｆ，Ｂｅｎｏｔｍａｎｅ　ＭＡ，Ｄｅｍｅｒｅｔ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｒｅ—　ｖｅａｌｓ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｉｔｏｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００４。６４（３）：８９５—９０３．　【３］Ｇｒｅｅｎ　ＫＬ。Ｇａｓｔｏｎ　Ｋ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｔｏｐｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃａｎｃｅｒｓ［Ｊ］．ＢｉｏＤｒｕｇｓ。２００６，２０　（４）：２０９—２１８．　［４］Ｈｕａｎｇ　ＬＷ。Ｃｈａｏ　ＳＬ，Ｃｈｅｎ　ＰＨ，ｅｔ　１．Ｍｕｌａｔｉｐｌｅ　ＨＰＶ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｉｎ　ｃｅｒ・　ｖｉｃａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＤＮＡ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｙｐｉｎｇ　ｉｎ　ａｒｃｈｉｖａｌ　ｔｉｓ—　染的癌细胞中将抑制细胞生长，使其细胞周期停在Ｇ１　期，衰老及凋亡。Ｅ２蛋白作为病毒ＤＮＡ复制和基因　表达的主要调控蛋白，在感染早期的病毒复制阶段和　宫颈上皮内瘤变Ｉ期（ＣＩＮ　Ｉ）高表达。这是因为在宫　颈上皮瘤后期病变和高恶性度的宫颈癌中，病毒基因　组线性化整合人人基因组中时，Ｅ２基因已经发生了断　裂　。最近也有研究发现，机体针对ＨＰＶ１６之Ｅ６、Ｅ７　ｓｕｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｖｉｍｌ，２００４，２９（４）：２７１—２７６．　［５］Ｉｍ　ＳＳ，Ｗｉｌｃｚｙｎｓｋｉ　ＳＰ，Ｂｕｒｇｅｒ　ＲＡ。ｅｔ　ａ１．Ｅａｒｌｙ　ｓｔａｇｅ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｌｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１８　ＤＮＡ　ｈａｖｅ　ｍｏｌｅ　ｎｏｄａｌ　ｍｅｔａｓ—　ｔａｓｉｓ　ａｎｄ　ｄｅｅｐｅｒ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｉｎｖａｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００３。９（１１）：　４１４５—４１５０．　［６］ＤｅＦｉｌｉｐｐｉｓ　ＲＡ，Ｇｏｏｄｗｉｎ　ＥＣ，Ｗｕ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏ—　ｍａｖｉｒｕｓ　Ｅ６　ａｎｄ　Ｅ７　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｓｅｎｅｓ—　ｃｅｎｃｅ，ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ＨｅＬａ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｍｌ，　２００３。７７（２）：１５５１—１５６３．　蛋白的细胞免疫在有些时候并不能彻底清除ＨＰＶ感　染的细胞，说明机体对高危型ＨＰＶ病毒（ＨＰＶ１６、　ＨＰＶ１８）Ｅ６、Ｅ７蛋白的反应与病变的自行消退没有必　然联系。Ｂｒａｎｄｓｍａ发现在兔乳头瘤（ｃｏｔｔｏｎｔａｉｌ　ｒａｂｂｉｔ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＣＲＰＶ）模型中，表达ＨＰＶ　Ｅ２的腺病毒　［７］Ｄｅｍｅｒｅｔ　Ｃ，Ｇａｒｃｉａ　Ｃａｒｒａｎｃａ　Ａ，Ｔｈｉｅｒｒｙ　Ｆ。ｅｔ　ａ１．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ—ｉｎｄｅ—　ｅｎｄｅｎｔｐ　ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌ—　ｌｏｍａｖｉｒｕｓ　１８　Ｅ２　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ。２００３。２２（２）：１６８—１７５．　［８］ＡｌｂａｒｒａｎＹ　ＣａｒｖａｊａｌＡ。ｄｅｌａＧａｒｚａＡ，ＣｒｕｚＱｕｉｍｚ　ＢＪ。ｅｔａ１．ＭＶＡ　Ｅ２　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒａｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　疫苗能清除ＨＰＶ的感染　。由此本文认为，Ｅ２蛋白　将是一个新的治疗性靶蛋白。现阶段有关Ｅ２基因的　疫苗已在宫颈上皮内瘤变中取得了初步的研究进　ｉｎ　ｍｅｎ　ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｉｎｔｒａｕｒｅｔｈｒａｌ　ｆｌａｔ　ｃｏｎｄｙｌｏｍａ：ａ　ｐｈａｓｅ　Ｉ／ＩＩ　ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．　Ｂｉｏ　Ｄｒｕｇｓ，２００７，２１（１）：４７—５９．　［９］Ｂｒａｎｄｓｍａ儿，Ｓｈｌｙａｎｋｅｖｉｃｈ　Ｍ。Ｚｈａｎｇ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｂｂｉｔｓ　ｗｉｈ　ａｔｌｌ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅ　ｐａｐｉＵｏｍａｖｉｒｕｓＥ２　ｐｒｏｔｅｉｎｌｅａｄｓ　展¨　。ＨｅＬａ细胞是宫颈癌细胞株系，因整合ＨＰＶ１８　Ｅ２基因而永生化。在本文的研究中，体外刺激外周血　ｔｏ　ｃｌｅａｒａｎｃｅ　ｏｆｐａｐｉｌｌｏｍａｓ　ａｎｄ　ｉｆｅｃｔｉｎｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｍｌ，２００４，７８（１）：１１６　一ｌ２３．　单个核细胞（ＰＢＭＣ），诱导表位特异性ＣＴＬ时，加入表　位肽的同时也加入了ｒｈｌＬ－２，培养２周后见到明显的　淋巴细胞增殖。在实验的最后结果中，肽段１、２、３的　［１Ｏ］Ｇａｒｃｉａ　Ｈｅｍａｎｄｅｚ　Ｅ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ　Ｓａｎｃｈｅｚ　ＪＬ，Ａｎｄｍｄｅ　Ｍａｎｚａｎｏ　Ａ，ｅｔ　１．Ｒｅｇｒｅｓｓｉａｏｎ　ｏｆ　ｐａｐｉＨｏｍａ　ｈｉｓｈ—ｇｒａｄｅ　ｌｅｓｉｏｎｓ（ＣＩＮ　２　ａｎｄ　ＣＩＮ　３）ｉｓ　ｓｔｉｍｕｌａｔｄ　ｂｙ　ｔｅｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＭＶＡ　Ｅ２　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖａｃ—　ｃｉｎｅ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ。２００６，１３（６）：５９２—５９７．　溶破率分别为６０．００％、７１．２９％和８０．００％，都具有明　显的杀伤效应，说明三条备选肽段均为ＨＰＶ１８Ｅ２蛋白　（编辑：余汇洋）　关于日期的用法　公历世纪、年代、年、月、日和时刻例如：公元前５世纪、２０世纪９０年代、１９９５年６月８日１４时３０分。　表示年份要写全称，１９９５年不能写成９５年或９５年；１９５３－－１９５８年不能写成１９５３　８年。年月日可以写成　１９９５—０６—０８。时刻用‘‘．”分隔的形式。如：１３时４５分８秒可以写成１３：４５：０８。　（本刊编辑部）