RNA干扰IDH2基因对HCT-8细胞增殖能力的影响

2024-07-29 作者:

第３８卷　第４期２０１２年７月吉　林　大　学　学　报　（医　学　版）

）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔＭｅｄｉｃｉｎｅＥｄｉｔｉｏｎ　　　　ｙ（

Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．４　

Ｊｕｌ．２０１２

６４９

）文章编号］６７１５８７２０１２０４０６４９０４　　［　１－Ⅹ（－－ＲＮＡ干扰ＩＤＨ２基因对ＨＣＴ８细胞增殖能力的影响－徐晓芳１，宋晗星＊，邢沈阳１，吕　强２，高江明２，赵　娜２，常　乐２，高　峰１，

宫鹏涛２，李建华２，张国才２，张西臣２

（吉林大学畜牧兽医学院动物科学系，吉林长春１１．３００６２；）吉林大学畜牧兽医学院预防兽医系，吉林长春１２．３００６２

［）摘　要］对结肠癌ＨＣＮＡ干扰（ＲＮＡｉＴ８细胞ＩＤＨ２基因表达的抑制作用及干扰后对ＨＣＴ８细　目的：研究Ｒ－－胞增殖的影响，为结肠癌的基因靶向治疗提供理论依据。方法：实验分ｓｉＲＮＡ干扰质粒转染组、阴性质粒对照／／组和ＨＣＴ８细胞空白对照组。构建靶向基因ＩＤＨ２的ｓｉＲＮＡ真核绿色荧光载体重组质粒ＰＧＰＵ６ＧＦＰＮｅｏ－－ＩＤＨ２，利用ＦｕＧＥＮＥ　ＨＤ转染剂转染ＨＣＴ８细胞，通过荧光定量ＰＣＲ检测ＩＤＨ２ｍＲＮＡ的表达情况及ＭＴＴ－法检测结肠癌ＨＣＴ８细胞增殖变化。结果：在荧光显微镜下进行细胞计数，细胞转染率为７４％。实时荧光定量－／／ＰＣＲ检测，ｓｉＲＮＡ重组质粒ＰＧＰＵ６ＧＦＰＮｅｏＩＤＨ２对ＩＤＨ２基因表达的抑制率为８５．０２％，与空白对照组比较－。ＭＴ。差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）Ｔ检测，干扰质粒转染组细胞的增殖能力明显低于空白对照组（Ｐ＜０．０５）结论：抑制ＩＤＨ２基因的表达可影响结肠癌细胞的增殖能力，提示ＩＤＨ２基因在结肠癌的发生发展中起重要作用，抑制ＩＤＨ２基因的表达可能成为一种治疗结肠癌的方法。［关键词］ＮＡ干扰；ＩＤＨ２基因；人结肠癌ＨＣＴ８细胞　Ｒ－［中图分类号］文献标志码］７８　　［　Ｑ　Ａ

ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＩＤＨ２ｏｎｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｏｌｏｎ　　　　　ｐ

ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓＨＣＴ８ｂｓｉＲＮＡ　　－ｙ　

１１２２２＊，，ＸＵ　ＸｉａｏｆａｎＳＯＮＧ　ＨａｎｘｉｎＸＩＮＧＳｈｅｎＬＶ　ＱｉａｎＧＡＯＪｉａｎｉｎＺＨＡＯ　Ｎａａｎ－－　－　－ｍｇ，ｇｇ，ｇｇ，ｙｇ，２１２２２２

，，，ＣＨＡＮＧＬｅＧＡＯＦｅｎＧＯＮＧＰｅｎｔａｏＬＩＪｉａｎｈｕａＺＨＡＮＧＧｕｏｃａｉＺＨＡＮＧＸｉｃｈｅｎ　　　－　－　－　，　－ｇ，ｇ

（，Ｃ，，１．ＤｅｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅｏｌｌｅｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒＭｅｄｉｃｉｎｅＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔ　　　　　　　　　ｐｇｙｙ　；２，ＣＣｈａｎｃｈｕｎ１３００６２，Ｃｈｉｎａ．ＤｅａｒｍｅｎｔｏｆＰｒｅｖｅｎｔｉｖｅＶｅｔｅｒｉｎａｒＭｅｄｉｃｉｎｅｏｌｌｅｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ　　　　　　　ｇｐｙｇ　

，，）ａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒＭｅｄｉｃｉｎｅＪｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔＣｈａｎｃｈｕｎ１３００６２，Ｃｈｉｎａ　　　ｙｙｇ　

：Ｏ）ＡｂｓｔｒａｃｔｂｅｃｔｉｖｅｏａｎａｌｚｅｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｅｆｆｅｃｔｏｆＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉｏｎｔｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＤＨ２ｇｅｎｅ　Ｔ　　　　　　　　　　ｙｙｐｊ　ｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓＨＣ７８ａｎｄｔｈｅｉｎｆｌｕｎｃｅｉｎｔｈｅｏｆｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ，ａｎｄｔｏａｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒｏｖｉｄｅｏｆ　　　　－　　　　　　　　　　　　　　ｐｐｂａｓｉｓｆｏｒｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｔａｒｅｔｅｄｔｈｅｒａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＴｈｅｅｘｅｒｉｍｅｎｔｗａｓｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｓｉＲＮＡｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｌａｓｍｉｄ　　　　　　　　　　　　ｇｐｙｐｐ，ｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌａｎｄＨＣＴ８ｃｅｌｌｓｃｏｎｔｒｏｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｗｈｉｃｈｃｏｎｔａｉｎｅｄｌａｓｍｉｄｒｏｕｓ．Ｔｈｅｌａｓｍｉｄ　　　　－　　　　　　ｇｐｇｐｐ／／）ｔｈｅｓｉＲＮＡｏｆｔｈｅＩＤＨ２ｇｅｎｅｉｎｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｕｋａｒｏｔｉｃｖｅｃｔｏｒ（ＰＧＰＵ６ＧＦＰＮｅｏＩＤＨ２ａｎｄｔｈｅｎｅａｔｉｖｅｒｅｅｎ　　　　　　　　　　－　　ｙｇｇｃｏｎｔｒｏｌｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｂｕｓｉｎＦｕＧＥＮＥ　ＨＤＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　　　　　　　　　　　　ｙｙｇ　　　ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＤＨ２ｇｅｎｅｍＲＮＡ　ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ．ＴｈｅａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆｃｏｌｏｎＲｅａｅｎｔ．Ｔｈｅ　　　　　　－　　　　　ｐｇｐｙ　，ｔｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂＭＴＴ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃｏｕｎｔｅｄｂｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｅｈｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｃｅｌｌｓｃａｎｃｅｒ　　　　　　　　　　ｙｙｐ　　／／ｗａｓ７４％．ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｒａｔｅｏｆＩＤＨ２ｍＲＮＡｉｎＰＧＰＵ６ＧＦＰＮｅｏＩＤＨ２ｇｒｏｕｗａｓ８５．０２％，ｗｈｉｃｈｈａｄ　　　　　　－　　ｙｐ　　［收稿日期］　２０１２０４１１－－［；吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题（基金项目］　国家“９７３”项目资助课题（２００６ＣＢ９１０５０５）２０１０１５８５，

）２００３０５５０２５，２０１０６０４４

［，女，辽宁省辽阳市人，在读动物科学硕士，主要从事肿瘤遗传学研究。作者简介］　徐晓芳（１９８６－）［：０，Ｅ－ｍ：ｘ）；通信作者］　邢沈阳（Ｔｅｌ４３１８７８３５１３８ａｉｌｉｎｓａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ－＠ｙｇｙ

：０，Ｅ－ｍ：ｘ）张西臣（Ｔｅｌ４３１８７８３６１５５ａｉｌｃｚｈａｎｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ－＠ｇｊ

６５０

吉林大学学报（医学版）８卷　第４期　２０１２年７月　第３

），ｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｃｏｍａｒｅｄｗｉｔｈＨＣＴ８ｃｅｌｌｓｃｏｎｔｒｏｌｒｏｕＰ＜０．０５．Ｃｏｍａｒｅｄｗｉｔｈｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｒｏｕ　　　　－　　　　　　ｇｐｐｇｇｐ（ｇｐ）ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｔｈｅａｂｉｌｉｔｏｆｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｃｅａｓｅｄｂＭＴＴａｓｓａＰ＜０．０５．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅ　　　　　　　　　　　　ｐｙｙｙ（　　ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｌａｓｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＤＨ２ｇｅｎｅｃａｎｉｎｆｅｃｔｔｈｅａｂｉｌｉｔｏｆｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．ＩｔｓｈｏｗｓｔｈａｔＩＤＨ２ｇｅｎｅａ　　　　　　　　　　　　　　　ｐｐｙｐｙ　ｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒａｎｄｉｔｍａｂｅｂｅｎｅｆｉｃｉａｌｉｎｆｉｎｄｉｎａｎｅｗｔｈｅｒａｆｏｒｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒ．ｒｏｌｅ　　　　　　　　　　　　　　　　ｐｙｇｐｙ　　　：Ｒ；；ＫｅｗｏｒｄｓＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＩＤＨ２ｇｅｎｅｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓＨＣＴ８　　　　－ｙ　

　　结肠癌是常见恶性肿瘤之一，在消化道肿瘤中

的发病率仅次于胃癌［

１－２］。据世界流行病学调查显示：目前我国结肠癌的发病率低于发达国家，但由于近年来环境及饮食结构的改变，其发病率呈明显上升趋势，成为人们健康的另一大杀手，因此对结

肠癌的研究也逐渐成为医学研究的热点之一［

３－４］。国内外学者研究发现：能量代谢在癌症的发生过程中起重要作用，其中三羧酸循环的３种酶：琥珀酸脱氢酶、延胡索酸酶和异柠檬酸脱氢酶（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇ

ｅｎａｓｅ，ＩＤＨ）在癌症中均可发生突变。如琥珀酸脱氢酶的突变可引起副神经节瘤和嗜铬细胞瘤的发生；延胡索酸酶的突变可导致肾

癌和平滑肌瘤［５－６］；而ＩＤＨ酶突变可产生神经胶质

瘤和急性髓性白血病。分析其原因，在于这些突变可能通过激活原癌基因或消除抑癌基因的途径导致

癌症的发生。Ｊｅｎｎｉｎｇ

ｓ等［７］

研究发现：ＩＤＨ２酶位于线粒体内参与三羧酸循环并提供能量，ＩＤＨ２的突变可导致正常酶作用和功能的获得性降低，从而导致α－酮戊二酸降低、Ｄ－２－羟戊二酸增加，而这可能是结肠癌发生的诱因之一。目前国内外对ＩＤＨ２基因的研究仅限于神经胶质瘤和急性髓性白血病等癌症中，在结肠癌中的作用尚未有相关报道。本实验拟应用ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）技术，抑制ＤＨ２基因在结肠癌细胞中的表达，观察ＩＤＨ２抑制后细胞的增殖变化，探索ＩＤＨ２基因在结肠癌发生与发展中的作用，从而为结肠癌的诊断及治疗探索出新的靶基因。　材料与方法

．１　主要试剂　靶向基因ＩＤＨ２ｓｉＲＮＡ干扰质粒由上海吉玛制药技术有限公司设计构建合成；大肠杆菌ＤＨ５α质粒小提试剂盒和凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；细胞总ＲＮＡ抽提试剂Ｔｒｉｚｏｌ购自Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ公司；ＢｉｏＥａｓｙ　ＴａｑｍａｎＣＲ　Ｍａｇｉｃ　Ｍｉｘ试剂盒购自杭州博日公司；人结肠癌ＨＣＴ－８细胞由本实验室保存。．２　干扰质粒的构建　由上海吉玛制药技术有限公司根据ＢＣ０７１８２８基因序列设计并合成ｓｉＲＮＡ

干扰质粒，命名为ＰＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ－ＩＤＨ２，ｓｉＲＮＡ阴性对照质粒命名为ＰＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ－ＩＤＨ２－ｓｈＮＣ。１．３　人结肠癌ＨＣＴ－８细胞的瞬时转染　用含１０％标准胎牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基（购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司），在３７℃、５％ＣＯ２条件下培养Ｈ

ＣＴ－８细胞，取对数生长期的细胞进行实验。待细胞融合度达６０％～７０％后弃去上清液，加入室温孵育２０ｍｉｎ后的干扰质粒与ＦｕＧＥＮＥ　ＨＤ转染剂（购自Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ公司）的混合溶液（质粒ＦｕＧＥＮＥ∶ＨＤ转染剂＝７μｇ∶４μ

Ｌ）及不含胎牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基，３７℃、５％ＣＯ２条件下培养６ｈ。弃去培养基，加入含１０％标准胎牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基，继续培养１８ｈ。在倒置显微镜下观察细胞内绿色荧光表达情况，并比较转染ｓｉＲＮＡ干扰质粒组、阴性对照质粒组和ＨＣＴ－８细胞组的变化，记录绿色荧光表达量及检测瞬时转染情况。

１．４　实时荧光定量ＰＣＲ标准品的制备　分别提取各组细胞总ＲＮＡ，测定各组ＲＮＡ浓度，并将其调整一致。按ＢｉｏＲＴ　Ｔｗｏ　Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｋｉｔ反转录试剂盒（购自ＢｉｏＦｌｕｘ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ公司）说明书，将ＲＮＡ逆转录成相应的ｃＤＮＡ，根据ＩＤＨ２基因ｃＤＮＡ序列设计引物，上游引物：５′－ＣＡＡＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＣＧＣＣＴＡＧＴＣ－３′，下游引物：５′－ＣＣＣＧＧＴＣＴＧＣＣＡＣＡＡＡＧＴ－３′。ＰＣＲ条件：９５℃、５ｍｉｎ；９５℃、３０ｓ，５９℃、３０ｓ

，７２℃、３０ｓ，３０个循环；７２℃、１０ｍｉｎ。用１％琼脂糖凝胶电泳分离回收目的片段，将纯化的ＰＣＲ产物与ｐＭＤ－１８Ｔ载体（购自ＢｉｏＦｌｕｘ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ公司）连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α

，涂板，挑取阳性克隆，摇菌，经ＰＣＲ鉴定并测序。提取重组质粒ＤＮＡ，纯化并测其浓度，以此作为荧光定量ＰＣＲ标准品。

１．５　实时荧光定量ＰＣＲ检测抑制效果　分别提取各组细胞总ＲＮＡ，按ＢｉｏＲＴ　Ｔｗｏ　Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲｋｉｔ反转录试剂盒说明书将ＲＮＡ逆转录成相应的ｃＤＮＡ，－８０℃冻存备用。ＰＣＲ引物序列同上，根

Ｉ１１Ｐ１徐晓芳，等．ＮＡ干扰ＩＤＨ２基因对ＨＣＴ８细胞增殖能力的影响　Ｒ－６５１

据ＰＣＲ扩增基因序列设计特异性探针，序列为５′－ＣＣＡＴＧＧＣＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡ－３′。荧光定量ＰＣＲ反应采用５０μＬ体系，其中，２×ＴａｑｍａｎＭｉｘ　２５μＬ，Ｔａｐ聚合酶２μＬ，１０μｍｏｌ·Ｌ－１探针１μＬ，上下游引物各１．５μＬ，待测样品ｃＤＮＡ３μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　

１７μＬ。反应条件：９５℃、２ｍｉｎ；９５℃、１５ｓ，６２℃、４０ｓ，４０个循环。每份样本均

行５复孔检测，取其循环阈值（Ｃｔ）均值。１．６　ＭＴＴ法检测细胞增殖情况　将细胞分为

ｓｉＲＮＡ干扰质粒转染组、阴性质粒对照组和ＨＣＴ－８细胞空白对照组。每组细胞用含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养液配制单细胞悬液，接种到９６孔板（每孔２００μＬ，含４×１０

３

个细胞），每组１２个孔重复，实验重复３次。３７℃、５％ＣＯ２

孵育培养１２～２４ｈ后，每孔加２０μＬ　ＭＴＴ溶液，继续孵育４ｈ，终止培养；小心弃去孔内上清液。每孔加１５０μＬ　

ＤＭＳＯ，振荡１０ｍｉｎ，使结晶物充分溶解。利用酶联免疫监测仪测定各孔４９０ｎｍ波长下吸光度（Ａ）值。以时间为横坐标，Ａ值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

１．７　统计学分析　应用ＳＰＳＳ　１３．０统计学软件进行统计学分析，ＩＤＨ２基因ｍＲＮＡ表达水平以ｘ±ｓ表示，组间比较采用方差分析（ＡＮＯＶＡ）。２　结　果

２．１　重组质粒瞬时转染细胞效率　在倒置荧光显微镜下观察转染４８ｈ后的ＨＣＴ－８细胞，可见部分细胞带绿色荧光，表明带有ＰＧＰＵ６／ＧＦＰ

／Ｎｅｏ－ＩＤＨ２的重组质粒已成功转染入ＨＣＴ－８细胞。通过细胞计数，计算转染效率为７４％（

图１，见封二）。

２．２　实时荧光定量ＰＣＲ检测ＩＤＨ２基因　以重组质粒ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ鉴定目的片段克隆正确，测序分析结果与目的基因同源性为１００％，表明该基因已成功克隆（图２

）。　　实时荧光定量Ｐ

ＣＲ技术检测ＩＤＨ２基因表达水平，通过ＳＰＳＳ　１３．０软件分析结果，得出ｓｉＲＮＡ干扰质粒对ＩＤＨ２基因表达的抑制率为８５．０２％。ｓｉＲＮＡ干扰质粒转染组中ＩＤＨ２基因的表达量（２．９８５±０．１００）与空白对照组（２５．３２８±０．９２０）比较明显下降（Ｐ＜０．０５），说明ｓｉＲＮＡ质粒对ＩＤＨ２基因的干扰效率较高；阴性质粒对照组中ＩＤＨ２基因的表达量（１９．９１０±０．８１０）与ＨＣＴ－８细胞空白对照组比较差异无统计学意义

（Ｐ＞０．０５

）。图２　ＰＣＲ扩增ＩＤＨ２基因目的片段

ｉｇ．２　Ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｎｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＤＨ２ｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｂｙ　

ＰＣＲＭ：ＤＬ　２　０００ｍａｒｋｅｒ；Ｌａｎｅ　

１：ＩＤＨ２ｇｅｎｅ．．３　ＨＣＴ－８细胞增殖检测　通过多次重复测量，以细胞增殖活性（Ａ值）的平均数为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。结果显示：ｓｉＲＮＡ干扰质粒转染组的细胞相对增殖率（４０．４２％）低于

阴性质粒对照组（９０．３３％），阴性质粒对照组与ＨＣＴ－８细胞空白对照组比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），表明ＩＤＨ２基因的表达可以抑制ＨＣＴ－８细胞生长（图３）。图３　各组细胞增殖活性比较

ｉｇ．３　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓｅｔｗｅｅｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｇｒｏｕｐ

ｓ：ｓｉＲＮＡ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ；２：Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｃｏｎｔｒｏｌｒｏｕｐ

；３：ＨＣＴ－８ｃｅｌｌｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．　讨　论

ＩＤＨ２基因是编码ＩＤＨ的基因，定位于人染

色体１５ｑ２６．１上［８］

。由于ＩＤＨ可催化异柠檬酸氧化生成草酰琥珀酸，然后进一步氧化脱羧生成α－酮戊二酸；而在线粒体中，ＩＤＨ２还可把ＮＡＤＰ（＋）作为辅助因子形成ＮＡＤＰＨ，因此该酶在三羧酸循环及谷胱甘肽生成中起十分重要的作用。

Ｆ２Ｆｂ１ｇ３６５２

吉林大学学报（医学版）８卷　第４期　２０１２年７月　第３

［４］吕　强，邢沈阳，赵志辉，等．结肠癌的研究现状及

］）：１展望［Ｊ．中国实验诊断学，２００９，１３（８１３４１１３７．－［］Ｋ５ｉｎＡ，ＳｅｌａｋＭＡ，ＧｏｔｔｌｉｅｂＥ．Ｓｕｃｃｉｎａｔｅｄｅｈｄｒｏｅｎａｓｅａｎｄ　　　　ｇｙｇ　

：ｌｆｕｍａｒａｔｅｈｄｒａｔａｓｅｉｎｋｉｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄ　　　ｙｇｙ　］，２）：４Ｊ．Ｏｎｃｏｅｎｅ００６，２５（３４６７５４６８２．ｃａｎｃｅｒ［－ｇ［］Ｙ６ａｎＨ，ＢｉｎｅｒＤＤ，ＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕＶ，ｅｔａｌ．Ｍｕｔａｎｔｍｅｔａｂｏｌｉｃ　　　　　ｇ

］，２ｅｎｚｍｅｓａｒｅａｔｔｈｅｏｒｉｉｎｏｆｌｉｏｍａｓ［Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ００９，　　　　　　　ｙｇｇ）：９６９（２４１５７９１５９．－［，Ｍ７］ＪｅｎｎｉｎｓＧＴ，ＭｉｎａｒｄＫＩｃＡｌｉｓｔｅｒ－ＨｅｎｎＬ．Ｅｘｒｅｓｓｉｏｎ　　　ｇｐ

ｕｔｅｎｅｓｉｓｆａｍｍａｌｉａｎｔｏｓｏｌｉｃＤＰ＋－ｓｅｃｉｆｉｃａｎｄ　ｍ　ｏ　ｍ　ｃ　ＮＡｇｙｐ］，１：ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅｄｅｈｄｒｏｅｎａｓｅ［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ９９７，３６（４４）　ｙｇｙ１３７４３１３７４７．－［］Ｚ８ｈａｏＳ，ＬｉｎＹ，Ｘｕ　Ｗ，ｅｔａｌ．Ｇｌｉｏｍａｄｅｒｉｖｅｄｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎ　　　　　　

ＩＤＨ１ｄｏｍｉｎａｎｔｌｉｎｈｉｂｉｔＩＤＨ１ｃａｔａｌｔｉｃａｃｔｉｖｉｔａｎｄｉｎｄｕｃｅ　　　ｙｙｙ　　］，２）：２１ａｌｈａ［Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ００９，３２４（５９２４６１２６５．ＨＩＦ－－ｐ［］Ｄ９ａｎＬ，ＷｈｉｔｅＤＷ，ＧｒｏｓｓＳ，ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄＩＤＨ１　　　－　ｇ　

，２ｍｕｔａｔｉｏｎｓｒｏｄｕｃｅ２ｈｄｒｏｘｌｕｔａｒａｔｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ００９，　　－ｐｙｙｇ）：９４６５（７３００６６．

［］Ｇ１０ｒｏｓｓＳ，ＣａｉｒｎｓＲＡ，ＭｉｎｄｅｎＭＤ，ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　　　　－ｈｄｒｏｘｌｕｔａｒａｔｅｃｃｕｍｕｌａｔｅｓｎｃｕｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　２－　ａ　ｉ　ａｙｙｇｍｅｌｏｅｎｏｕｓｌｅｕｋｅｍｉａｗｉｔｈｉｓｏｃｉｔｒａｔｅｄｅｈｄｒｏｅｎａｓｅ１ａｎｄ２　　　　　　ｙｇｙｇ］，２）：３ｍｕｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ．ＪＥｘＭｅｄ０１０，２０７（２３９３４４．　－ｐ　［］Ｗ，Ｗ１１ａｒｄＰＳ，ＰａｔｅｌＪｉｓｅＤＲ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｃｏｍｍｏｎｆｅａｔｕｒｅｏｆ　　　　　　　

ｌｅｕｋｅｍｉａａｓｓｏｃｉａｔｅｄＩＤＨ１ａｎｄＩＤＨ２ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｓａｎｅｏｍｏｒｈｉｃ－　　　　　ｐｅｎｚｍｅｃｔｉｖｉｔｏｎｖｅｒｔｉｎｌｈａ－ｋｅｔｏｌｕｔａｒａｔｅｏ　ａ　ｔｙｙｇｐｇ　ｃ　ａ］，２：２ｈｄｒｏｘｌｕｔａｒａｔｅ［Ｊ．ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ０１０，１７（３）２５２－　－ｙｙｇ２３４．

［１２］ＺｈａｏＳ，ＬｉｎＹ，Ｘｕ　Ｗ，ｅｔａｌ．Ｇｌｉｏｍａｄｅｒｉｖｅｄｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎ　　　　　

ＩＤＨ１ｄｏｍｉｎａｎｔｌｉｎｈｉｂｉｔＩＤＨ１ｃａｔａｌｔｉｃａｃｔｉｖｉｔａｎｄｉｎｄｕｃｅ　　　ｙｙｙ　　］，２）：２１ａｌｈａ［Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ００９，３２４（５９２４６１２６５．ＨＩＦ－－ｐ［］Ｐ１３ａｒｓｏｎｓＤＷ，Ｊｏｎｅｓｈａｎｔｌ．Ａｎｎｔｅｒａｔｅｄ　　Ｓ，Ｚ　ａ　ｉｇｇ　Ｘ，ｅ

ａｎａｌｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ［Ｊ］．ｅｎｏｍｉｃ　　　　　ｇｙｇ

，２）：１Ｓｃｉｅｎｃｅ００８，３２１（５８９７８０７１８１２．－［］Ｙ１４ａｎＨ，Ｐａｒｓｏｎｓｉｎｔｌ．ＩＤＨ１ａｎｄＤＨ２　　ＤＷ，Ｊ　Ｇ，ｅ　ａ　Ｉ

］，２：ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｌｉｏｍａｓ［Ｊ．ＮＥｎｌＪＭｅｄ００９，３６０（８）　　　　　ｇｇ７６５７７３．－完整的ＩＤＨ活性可保护细胞免于氧化应激，而突变的ＩＤＨ与异柠檬酸的亲和力降低，且突变体催化α－酮戊二酸，最终导致α－酮戊二酸的供应减少

［］９１１－。α－酮戊二酸的减少又可导致促进肿瘤生

长的厌氧诱导因子水平显著升高，因而诱发肿瘤。目前已有研究证实：细胞内编码ＮＡＤＰ（＋）依赖性ＩＤＨ亚型基因ＩＤＨ１和ＩＤＨ２的突变可促进

１２］

；并且发现Ｉ肿瘤发生［ＤＨ１和ＩＤＨ２在ＷＨＯⅤ

级的神经胶质瘤、ＷＨＯⅡ级和Ⅲ级的星状细胞瘤

等脑瘤中经常发生突变要作用。

［］１３１４－。以上这些研究成果提

示：ＩＤＨ２基因可能在肿瘤的发生发展过程中起重

本实验应用ＲＮＡｉ技术，构建ＩＤＨ２基因的特异性干扰质粒，转染结肠癌ＨＣＴ８细胞，观察－ＩＤＨ２基因的表达及对ＨＣＴ８细胞的增殖影响。－通过荧光定量ＰＣＲ对其ｍＲＮＡ表达量进行检测，结果显示：ＩＤＨ２ｍＲＮＡ表达量明显降低（Ｐ＜），表明Ｉ０．０５ＤＨ基因已被转染的ｓｉＲＮＡ重组质粒成功抑制。进一步通过ＭＴＴ检测结果显示：沉默ＩＤＨ２基因后ＨＣＴ８细胞的增殖速度明显降低，－说明ＩＤＨ２基因对ＨＣＴ８细胞的体外增殖有显著－的抑制作用。根据本实验结果及国内外学者的研究推测：ＩＤＨ２基因有可能成为结肠癌诊断及治疗的一个新的靶基因。

［参考文献］

［］吕　强，邢沈阳，张西臣，等．ＲＮＡ干扰Ｐ１ＴＥＮ基因对

］ＨＣＴ８细胞增殖能力的影响［Ｊ．吉林大学学报：医学版，－）：２２０１１，３７（２３１２３５．－［］王玺皓，龙汉安．ＲＮＡ２ｉ技术在结肠癌研究与治疗方面的

］）：９应用［Ｊ．西南军医，２００９，１１（５１６９１８．－［］姜跃龙，许　乐．熊去氧胆酸与结肠癌研究进展［］３Ｊ．临床药

）：４物治疗杂志，２０１０，８（１９５１．－００８级＊吉林大学白求恩医学院临床医学系五年制２

《》网上投稿须知吉林大学学报（医学版）

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