HPV58 E6的基因克隆及HLA-DQB1*03限制性T细胞表位分析

2024-07-29 作者:

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１００４　！量ｓＮ　！＝　３８细胞与分子免疫学杂志（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏ１）２００７．２３（１１　・论著・　文章编号：１００７—８７３８（２００７）１１—１００４—０３　ＨＰＶ５８　Ｅ６的基因克隆及Ｉ　Ａ－ＤＱＢ１术０３限制性Ｔ细胞表位分析　陈凌。，沈柱　，伍津津。，张　菊　，周　杨　，范雪莉　（　第三军医大学大坪医院野战外科研究所皮肤科重庆　，４０００４２；　第四军医大学西京医院皮肤科，陕西西安７１００３２；　第四军医大学全军基因诊断研究所，陕西西安７１００３２；　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｈｏｏｌ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ　０１６０５，ＵＳＡ）　　Ｃｌｏｎｅ　ｏｆ　Ｉ－ＩＰＶ５８　Ｅ６　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　后续相关实验中表位筛选、鉴定和多肽疫苗研制的候选对象。ＨＩ．Ａ－ＤＱＢ１木０３　ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　Ｔ－ｃｅｌｌ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　ＣＨＥＮ　Ｌｉｎｇ，ＳＨＥＮ　Ｚｈｕ　，删Ｊｉｎ－ｊｉｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｊｕ，　ＺＨＯＵ　凡ｇ，ＦＡＮ　Ｘｕｅ－ｌｉ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂａｔｔｌｅ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｄａｐｉｎｇ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｈｉｒｄ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　ＭｅＳｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙｔ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４０００４２，　Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔｊ　ＡｎＩ：Ｔ０　ｃｌｏｎｅ　ＨＰＶ５８　Ｅ６　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ＨＬＡ・ＤＱＢ１｝０３・ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　Ｔ　ｃｅｌＩ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　０ｎ　Ｅ６　ｐｒｏｔｅｉｎ．　ＭＥＴＨｏＤＳ：Ｔ０ｔａＩ　ｇｅｎｏｍｅ　ＤＮＡ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒ０ｍ　ａ　ｃｅｒｖｉ．　ｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｓａｍｐｌｅ．Ｔｈｅ　ＨＰＶ５８　Ｅ６　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｉｎｓｅｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＧＥＭ・Ｔ　Ｅａｓｙ　ｖｅｃｌ０ｒ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉ．　ｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｌｒｊｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ａｎａ１．　ｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＨＬＡ－ＤＱＢ　１｝０３・ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　Ｔ　ｃｅｌＩ　ｅｐ￣ｏｐｅｓ　ｏｎ　Ｅ６　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ・ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｃｏｒｉｎｇ　ｍａｔｒｉｘ，ｓｕｐｐｏｄ　ｖｅｃｔｏｒ　ｍａｃｈｉｎｅ　ｔｈｅ－　ｏｒｙ　ａｎｄ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ　ｃｌｅａｖａｇｅｓ．　ＲＥｓｌⅡ　ＴＳ：Ａ　ＨＰＶ５８　Ｅ６　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ　ｔｏ　ＧｅｎＢａｎｋ（ＥＲ）（　２３９）．Ｅｐｉｔｏｐｅ　４７（ＦＡＤＬＲＩＡＹ－　ＲＤＧＮＰＦＡ）ａｎｄ　Ｅｐ￣ｏｐｅ　１０２（ＲＣＩＩＣＱＲＰＬＣＰＱＥＫＫ）ｗｅｒｅ　ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ　ＨＬＡ－ＤＱＢ　１｝０３－ｒｅｓｔｒｉｔｃｅｄ　Ｔ　ｃｅｌＩ　ｅｐ￣ｏｐｅｓ　ｏｎ　Ｅ６　ｐｒｏｔｅｉｎ．ＣｏＮＣＬＵｓｌｏＮ：Ｔｈｅｓｅ　ｔｗｏ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ｓｅｒｖｅ　ａｓ　ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ　ｆｏｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ＨＰＶ５８　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｕ￣ｈｅｒ　ｓｔｕｄｙ．　［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ＨＰＶ５８；Ｅ６；ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｔ　ｃｅｌｌ　ｅｐｉｔｏｐｅ　［摘要］　目的：克隆ＨＰＶ５８　Ｅ６的基因，并对其ＨＬＡ－ＤＱＢ１　０３限制性Ｔ细胞表位进行分析。方法：从宫颈癌组织中提　取基因组ＤＮＡ，通过ＰＣＲ方法扩增ＨＰＶ５８　Ｅ６基因，常规方　法将目的基因插入ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ载体中。酶切和测序鉴定　后，利用位置特异性分数矩阵（ＰＳＳＭ）理论、支持向量机　（ＳＶＭ）理论和蛋白酶体酶切位点预测算法分析ＨＰＶ５８　Ｅ６的　ＨＬＡ．ＤＱＢ１｝０３限制性Ｔ细胞表位。结果：成功克隆了１株　ＨＰＶ５８　Ｅ６基因（ＧｅｎＢａｎｋ　ＥＦ０６０２３９），表位４７　ＦＡＤＬＲＩＡＹ－　ＲＤＧＮＰＦＡ和表位１０２　ＲＣＩＩＣＱＲＰＬＣＰＱＥＫＫ理论上是其ＨＬＡ－　ＤＱＢ１　０３限制性Ｔ细胞表位。结论：这两个表位可望作为　收稿日期：２００６—１２—１２；接受日期：２００７一Ｏ１—１８　基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０５７２１１２，３０６００５５８）　作者简介：陈凌（１９８０一），女，重庆人，硕士　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕ￣ｏｒ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｅｎｚｈｕ＠ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　［关键词］ＨＰＶ５８；Ｅ６；基因克隆；Ｔ细胞表位　［中图分类号］Ｑ７８１　［文献标识码］Ａ　高危型人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ，　ＨＰＶ）感染被认为是宫颈癌的主要致病因素。世界各　地高危型ＨＰＶ的感染率区别较大，ＨＰＶ５８在亚洲地　区表现出不同寻常的流行状况。我国学者对ＨＰＶ５８　的研究已走在世界前列，研究表明ＨＰＶ５８　Ｅ６是最终　导致细胞发生恶性转化的关键环节，可作为发展　ＨＰＶ相关宫颈癌及其癌前病变治疗性疫苗的理想靶　抗原…。另一方面，并非所有感染ＨＰＶ５８的妇女都　发展为宫颈癌，因此认为其他因素，包括遗传背景，　在宫颈癌的发生、发展过程中也可能起着促进作用。　我们以往的研究表明，ＨＬＡ等位基因ＤＱＢ１　０３可　能与宫颈癌的发生具有相关性　。我们从宫颈癌组　织中扩增得到１株ＨＰＶ５８　Ｅ６基因，提交ＧｅｎＢａｎｋ　后，获得编号ＥＦ０６０２３９，并对其ＨＬＡ—ＤＱＢ１　０３限　制性Ｔ细胞表位进行了分析。　１材料和方法　１．１材料标本取自西京医院妇产科１例（３８岁）宫颈癌患　者的活检组织，病理学检查确诊为腺癌Ⅱ级，按ＦＩＧＯ分期为　ＩＩ　ａ。ＤＮＡ片段回收试剂盒（Ｃｏｎｃｅｒｔ　Ｒａｐｉｄ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）购自美国Ｇｉｂｃｏ公司；克隆载体连接试剂盒（ｐＧＥＭ　Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｉ）和质粒提取试剂盒（Ｗｉｚａｒｄ＠Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ－　ｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司；Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶和限制性内切酶购自ＴａＫａＲａ公司；ＨＰＶ５８　Ｅ６基　因特异性引物根据标准序列（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｄ９０４００），利用Ｐｒｉｍ－　ｅｒ５．０软件设计，由北京赛百盛公司合成，上游引物：５　－ＣＧ－　ＧＡＧＣＴＣＡＣＴＡＴＧＴＹＣＣＡＧＧＡＣＧＣＡＧ．．３，含Ｓａｃ　Ｉ酶切位点，　下游引物为：５　－ＧＣＡＡＧＣＴＹＣＧＴＹＧＴＹＡＣＡＧＧＴＹＡＣＡＣＴＹＧＴＧ－　３　，含ＨｉｎｄⅢ酶切位点。　１．２方法　１．２．１软件和服务器ＤＮＡＭＡＮ　４．０；ＢＬＡＳＴ服务器（ｈｔｔｐ：／／　ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）；Ｂａｎｋｌｔ服务器（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．　ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢａｎｋＩｔ／）Ｒａｎｋｐｅｐ服务器（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉ－　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ．ｏｒｇ／Ｔｏｏｌｓ／ｒａｎｋｐｅｐ．ｈｔｍ１）；ＰＡＰｒｏＣ服务器（ｈｔｔｐ：／／　ｗｗｗ．ｐａｐｒｏｃ２．ｄｅ／ｐａｐｒｏｃ１／ｐａｐｒｏｃ１．ｈｔｍ１）；ＮｅｔＣｈｏｐ　３．０服务器　（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＣｈｏｐ／）；ＭＨＣ２Ｐｒｅｄ服务　维普资讯

ｌｓ　！＝８７３８细胞与分子免疫学杂志（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　ｌｍｍｕｎｏ１）２００７，２３（１　１）　Ｍ１　１　２　３　４　５　Ｍ２　器（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｅｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｍｈｅ２ｐｒｅｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ１）。　１．２．２扩增ＨＰＶ５８　Ｅ６基因取患者组织块少许剪碎研磨，　细胞悬液加入１００　ＩＬＬ蛋白酶Ｋ裂解组织提取液（ＥＤＴＡ　０．１　ｍｍｏｌ／Ｌ，ＳＤＳ　１０　ｇ／Ｌ，蛋白酶Ｋ　２００　ｍｇ／Ｌ），５６￣Ｃ温育３０　ｍｉｎ，　３７￣Ｃ温育１２　ｈ，酚／氯仿法抽提模板ＤＮＡ。取ＤＮＡ模板１　ＩＬＬ，　一目　２】　０７５（ｈｑ　１Ｏ５　加入ＨＰＶ５８　Ｅ６基因特异性引物，扩增靶片段ＤＮＡ。ＰＣＲ反　应体系为２５　Ｉ．ＬＬ：ｄＮＴＰ　１５０　ｉ．Ｌｍｏｌ／Ｌ，引物各２５　ｐｍｏｌ／Ｌ，　酶１．０　Ｕ。扩增条件：９４￣Ｃ变性５　ｍｉｎ，９４℃４０　ｓ，５８￣Ｃ　４０　ｓ，　７２￣Ｃ　１　ｍｉｎ，３５个循环，７２￣Ｃ延伸６　ｍｉｎ。１５　ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶　电泳检测ＰＣＲ结果。　１．２．３　ＨＰＶ５８　Ｅ６基因克隆质粒的构建和鉴定ＰＣＲ产物经　琼脂糖凝胶电泳后，参照试剂盒及克隆载体连接试剂盒说明　回收目的片段，将目的片段与克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ连接，　转化Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９感受态细胞，氨苄青霉素抗性挑取ｐＧＥＭ－　Ｔ－５８　Ｅ６重组质粒，并进行Ｓａｃ　Ｉ和ＨｉｎｄⅢ双酶切鉴定。含有　４７０　ｂｐ外源ＤＮＡ片段的克隆为阳性克隆，送上海Ｓａｎｇｏｎ生　物工程公司测序，对测序结果进行ＢＬＡＳＴ同源性分析，利用　Ｂａｎｋｌｔ服务器进行序列提交。　１．２．４　ＨＰＶ５８　Ｅ６　㈣謇晏　Ｔ细胞表位分析利用软件ＤＮＡＭＡＮ　４．０　和服务器Ｒａｎｋｐｅ、ＰＡＰｒｏＣ、ＮｅｔＣｈｏｐ　３．０及ＭＨＣ２Ｐｒｅｄ，使用　位置特异性分数矩阵（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｓｃｏｒｉｎｇ　ｍａｔｒｉｘ，简称　ＰＳＳＭ）　和蛋白酶体酶切位点预测算法（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ　ｃｌｅａｖａｇｅｓ）　以及支持向量机（Ｓｕｐｐｏｒｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ｍａｃｈｉｎｅ，简称ＳＶＭ）理论　，进行ＨＩＪＡ—ＤＱＢ１￥０３限制性Ｔ　细胞表位分析。　２结果　２．１　ＨＰＶ５８　Ｅ６基因的扩增从宫颈癌患者组织ＤＮＡ中　ＰＣＲ扩增ＨＰＶ５８　Ｅ６基因，连同引物两端增设的Ｓａｃ　Ｉ和ＨｉｎｄⅢ　酶切位点和保护碱基，扩增片段长度应为４７０　ｂｐ。琼脂糖凝胶　电泳可见一清晰的扩增条带，片段大小与预期相符（图１Ａ）。　２．２　ＨＰＶ５８　Ｅ６基因克隆质粒的鉴定ｐＧＥＭ—Ｔ－５８　Ｅ６重组　质粒进行Ｓａｃ　Ｉ和ＨｉｎｄⅢ双酶切鉴定，可见释放出大小为　４７０　ｂｐ片段，与插入片段大小相符（图１Ｂ）。经自动测序仪测　序，ＢＬＡＳＴ同源性分析证实，插入片段为ＨＰＶ５８　Ｅ６基因的　一株（图２），与ＧｅｎＢａｎｋ收录的ＨＰＶ５８原型（Ｄ９０４００）的同源　性为９８．８９％。利用Ｂａｎｋｌｔ服务器进行序列提交，获得Ｇｅｎ—　Ｂａｎｋ标识ＥＦ０６０２３９。　２．３　ＨＰＶ５８　Ｅ６　ＨＬＡ．ＤＱＢＩ￥０３限制性Ｔ细胞表位分析　使用ＲＡＮＫＰＥＰ服务器的位置特异性分数矩阵（ＰＳＳＭ）理论和　ＭＨＣ２Ｐｒｅｄ服务器的支持向量机（ＳＶＭ）理论，计算得到如下　ＨＰＶ５８　Ｅ６　ＨＩＡ．ＤＱＢ１￥０３限制性Ｔ细胞表位：表位４７　ＦＡＤＬ－　ＲＩＡＹＲＤＧＮＰＦＡ和表位１０２　ＲＣＩＩＣＱＲＰＬＣＰＱＥＫＫ（４７和１０２代　表氨基酸起始位置）。使用ＰＡＰｒｏＣ和ＮｅｔＣｈｏｐ　３．０服务器的　蛋白酶体酶切位点预测算法分析ＨＰＶ５８　Ｅ６蛋白中含有多个　潜在的蛋白酶体酶切位点（图３Ａ），其中ＲＡＮＫＰＥＰ和　ＭＨＣ２Ｐｒｅｄ服务器预测分析得到的ＨＩＪＡ－ＤＱＢ　１￥０３限制性表　位４７和表位１０２正好位于两个强度大的酶切位点之间　（Ｆ２４５．５１８一Ｖ　１３５．６８３．图３Ｂ；Ｒ　１３３．６５２０一Ｒ　１３５．０２１５，图　３ｃ）。提示这几种预测方法结果的一致性。　图１　ＨＰＶ５８　Ｅ６基因ＰＣＲ扩增（Ａ）和ｐＧＥＭ－Ｔ－５８　Ｅ６重组质　粒的酶切鉴定（Ｂ）　Ｆｉｇ　１　Ａｍｐｌｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＰＶ５８　Ｅ６　ｇｅｎｅ　ｔｈ　ＰＣＲ（Ａ）ａｎｄ　ｃｏｎｆｉｒ－　ｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐＧＥＭ－Ｔ－５８　Ｅ６　ｂｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｅｌｅａｓｅ（Ｂ）　Ｍ１，Ｍ２：ＤＬ２０００　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒｓ；１，２：ＨＰＶ５８　Ｅ６　ｇｅｎｅ；３：Ｂｌａｎｋ　ｃｏｎ－　ｔｒｏｌ；４：ｐＧＥＭ－Ｔ－５８　Ｅ６：５：ｐＧＥＭ－Ｔ－５８　Ｅ６／Ｓａｃ　Ｉ　ａｎｄＨｉｎｄⅢ．　ＨＰＶ５８　Ｄ９０４００　ＡＴＧＴＴＣＣＡＧＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＡ【　ＡＡＡＣＣＡＣＧＧＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧ　４０　ＨＰＶ５８　Ｅ６　一一一‘…一一　一　‘　一　一一一一一一一一　一一～一一４０　ＨＰＶ５８　Ｄ９０４００　ＡＴＴＴＧＴＧＴＣＡＧＧＣＧＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＣＴ（ｊＴＧＣＡＴＧＡＡＡＴＣＧＡ　８Ｏ　ＨＰＶ５８　Ｅ６’　一一一　一一一一　一一　～一　ａ一一～一　８０　｝｛ＰＶ５８　１）９（ＭＯＯ　Ａ丌ＧＡＡＡＴＧＣＧＴＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＴＧＣＡＧＣＧＡＴＣＴ　１　２０　ＨＰＶ５８　Ｅ６’　一一一一一　一一一一　一一一　一　一一　１　２Ｏ　ＨＰＶ５８　Ｄ９０４００　ＧＡＧＧＴＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧ（’ＡＧ　ＴＴＴＡＡＧＡ　ｒＡＧＴＧＴ　１６Ｏ　ＨＰＶ５８　Ｅ６　一一一一一一一一一　一　＿＿＿一一　ｃ一一ｆ６０　ＨＰＶ５８　Ｄ９０４００　ｒＡＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＴ（。ＣＡＴＴＴＧＣＡＧＴ　ＧＴＡＡＡＧＴＧＴＧＣＴＴ　２００　ＨＰＶ５８　Ｅ６　…＿＿……………一……………一一２ｏ０　ＨＰＶ５８　Ｄ９０４００　ＡＣＧＡＴＴＧＣＴＡＴＣＴＡＡＡＡＴＡＡＧＴＧＡＧＴＡＴＡＧＡＣＡＴＴＡＴＡＡＴ　２４０　ＨＰＶ５８　Ｅ６　一一一一一　一‘　一一一　一　ａ　２４０　ＨＰＶ５８　１）９０４００　ＴＡｌＴＴＣＧＣＴ　Ｔ＿ＡＴＧＧＡＧＡ【’ＡＣＡＴＴＡＧＡＡＣＡＡＡＣＡ（、ＴＡＡＡＡＡ　２８０　ＨＰＶ５８　Ｅ６　一一一一一一一一一　～　～一　一一　…ｃ　２８０　ＨＰＶ５８　Ｄ９０４００　ＡＧＴＧＴＴＴＡＡＡＴＧ　ＡＡＴ／、ＴＴＡＡＴＴＡＧＡＴＧＴＡＴＴＡＴＴＴＧＴＣＡ　３２０　ＨＰＶ５８　Ｅ６　一一一一一一，一ａ一一一　一　一　一一一一一　３２０　｝１ＰＶ５８　Ｄ９０４００　ＡＡＧＡＣＣＡＴＴ（　Ｔ（　Ｔ　（’ＡＣＡＡ（　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧ　ＡＴＧＴＧＧＡＴ　３６０　ＨＰＶ５８　Ｅ６’　一一一一～一。一一一一　一一　一　一一～’’一　一一一一　‘３６０　ＩｔＰＶ５８　Ｄ９（１４００　ＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＧＧＴＴＴＣＡＴＡＡＴＡＴＴＴＣＧＧＧＴ　ＧＴＴＧＧＡＣＡＧ　４００　Ｉ１ＰＶ５８　Ｅ６　一一一一一　一　一…一一一　４００　ＨＰＶ５８　Ｄ９（１４００　ＧＧＣＧＣＴＧＴＧ【’ＡＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＧＡＣＣＣＣＧＡＣＧＴＡＧＡＣＡＡＡ　４４Ｏ　ＨＰＶ５８　Ｅ６　一一＿＿＿…一　＿＿一　…＿＿＿一４４０　ＨＰＶ５８　Ｄ９０４ｏ０　ＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡ　４５０　｝｛ＰＶ５８　Ｅ６　一　一一４５０　图２克隆得到的ＨＰＶ５８　Ｅ６编码区基因（ＥＦ０６０２３９）与原型　（Ｄ９０４００）序列比对结果　Ｆｉｇ　２　Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｌｉｇｍｎｅｎｔ　ｒｅｓｕｌｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ＨＰＶ５８　Ｅ６　ｇｅｎｅ（ＥＦ０６０２３９）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ　（Ｄ９０４００）　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ＨＰＶ５８　Ｄ９０４００（ｕｐｐｅｒ　ｌｉｎｅ）ａｎｄ　ＨＰＶ５８　Ｅ６’（１ｏｗｅｒ　ｌｉｎｅ）　ｉｄｅｎｔｉｔｙ＝９８．８９％．　ｌｌ　Ｊ　Ａ　喜４００　善３００　Ｕ　２００　磊　１００ｎ　　ｌ　川　．Ｉ１　ｌ．　。－　４ｆ　”‘　。，　ｌ　ｉ：　。　１．。　．。：　图３人蛋白酶体酶切位点预测算法分析ＨＰＶ５８　Ｅ６可能存　在的蛋白酶体酶切位点　Ｆｉｇ　３　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｓｉｔｅｓ　ｉｎ　ＨＰＶ５８　Ｅ６　ｂｙ　ＰＡＰｒｏＣ　ａｎｄ　ＮｅｔＣｈｏｐ　３．０　ｓｅｒｖｅｒｓ　Ｘ－ａｘｉｓ　ｓｔａｎｄｓ　ｆｏｒ　ａｒｍｎｏ　ａｃｉｄ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｙ－ａｘｉｓ　ｆｏｒ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ．　维普资讯

志（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏ１）２００７，２３（１１　３讨论　ＲＩＡＹＲＤＧＮＰＦＡ和表位１０２　ＲＣＩＩＣＱＲＰＬＣＰＱＥＫＫ理论　ＨＰＶ感染是宫颈癌的首要诱因。最近多数文献　上是其ＨＬＡ—ＤＱＢ１　０３限制性Ｔ细胞表位，提示这　报道，具有高度致癌危险性的除了ＨＰＶ１６型和１８型　两个表位可作为后续实验中表位筛选、鉴定和多肽　以外，还有３１、３３、３５、３９、４５、５６、５８与６５型等，　疫苗研制的候选对象。尽管目前在多肽疫苗的研制　因素，制备出适合我国人群应用的有效疫苗，通过疫　其中中国妇女宫颈癌标本中ＨＰＶ５８型的检出阳性率　道路上存在众多问题，但考虑ＨＰＶ５８在亚洲的高发　极高，是仅次于ＨＰＶ１６的的高发型…。ＨＰＶ５８型为　最早从我国江西省一例宫颈癌组织中发现的一个新　苗接种以防治ＨＰＶ感染，仍将是一个非常艰巨而迫　型别。近来的流行病学研究显示，ＨＰＶ５８型的感染　切的课题。　率在沿海地区呈上升趋势，而ＨＰＶ１６型的感染率下　降。个别省份，如江西省ＨＰＶ５８型与ＨＰＶ１６型的检　出率相近，同时二者在宫颈各组病变的检出强度趋　势基本一致　Ｊ。由此可见，在我国ＨＰＶ５８型感染与　宫颈癌关系密切。但并非所有感染ＨＰＶ５８的妇女都　发展为宫颈癌，因此认为其他因素在宫颈癌的发生、　发展过程中也可能起着促进作用，其中包括对　ＨＰＶ５８感染后恶性转化的遗传易感素质。我们前期　的研究对陕西地区妇女ＨＬＡ—ＤＱＢ１％０３和ＤＲ１５等　位基因的分布特征作了初步探索，频率数值与欧美　国家相比有差异，说明了Ｉ－ＩＪＡ等位基因分布的种群　多态性，研究结果支持ＨＬＡ—ＤＱＢ１　０３等位基因与　宫颈癌的发生具有相关性这一结论　Ｊ。　ＨＰＶ５８基因组中Ｅ６主要与细胞周期调控紊乱和　恶性转化有关，是其致癌的关键环节，在ＨＰＶ５８的　致瘤机制和生物治疗的研究中倍受重视。以ＨＬＡ一Ⅱ　类抗原限制性的免疫治疗以主动免疫方式激活免疫　系统，诱导Ｔｈｌ为主细胞免疫应答，可控制早期　ＨＰＶ病毒的增殖。Ｔｈｌ细胞免疫应答还能诱发机体　产生中和抗体，以中和病毒，减少病毒感染细胞数，　并帮助肿瘤特异性杀伤性Ｔ淋巴细胞更为有效地清　除病毒。　为此我们从宫颈癌组织中扩增得到１株ＨＰＶ５８　Ｅ６（ＧｅｎＢａｎｋ　ＥＦ０６０２３９）基因，并使用位置特异性分　数矩阵、支持向量机和蛋白酶体酶切位点预测算法分　析了ＨＰＶ５８　Ｅ６　Ｔ细胞表位。结果显示表位４７　ＦＡＤＬ一　抗原表位的预测分析可以克服传统表位确定方　法中耗费巨大的人力、物力和财力等不足　，本研究　避开以往研究表位的常用方法如酸洗脱法或合成重　叠肽方法，对ＨＰＶ５８　Ｅ６　ＨＬＡ—ＤＱＢ１％０３限制性表位　进行了分析预测，因为该表位为理论分析所得，所以　本研究仅为今后相关基础和临床针对ＨＰＶ感染的肽　疫苗研究提供了候选表位。　参考文献：　［１］杨海宁，于修平，卞继峰，等．人乳头瘤病毒５８型Ｅ６蛋白对ｐ５３　的作用研究［Ｊ］．中华微生物学和免疫学杂志，２００３，２３（４）：２９６　—２９９．　［２］夏琳，张菊，陈中灿，等．宫颈癌与ＨＬＡ等位基因ＤＱＢ１　０３、ＤＲＩ５的相关性研究［Ｊ］．第四军医大学学报，２００４，２５（２４）：　２２６４—２２６６．　［３］Ｒｅｃｈｅ　ＰＡ，Ｇｌｕｔｔｉｎｇ　ｊＰ，Ｚｈａｎｇ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　ＲＡＮＫ－　ＰＥＰ　ｒｅｓ０ｕｒｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ＭＨＣ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｒｕｅｔｉｃｓ，２００４，５６（６）：４０５—４１９．　［４］Ｎｕ￣ｂａｕｍ　ＡＫ，Ｋｕｔｔｌｅｒ　Ｃ，Ｈａｄｅｌｅｒ　ＫＰ，ｅｔ　ａ１．ＰＡＰｒｏＣ：ａ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ　ｃｌｅａｖａｇｅｓ　ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｗｗｗ［Ｊ］．Ｉｍ－　ｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，５３（２）：８７—９４．　［５］Ｂｈａｓｉｎ　Ｍ，Ｒａｇｈａｖａ　ＧＰ．ＳＶＭ　ｂａｓｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ　ＨＬＡ－ＤＲＢ１　￥０４０１　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎ　ａｉｒ｝ａｎｔｉｇｅｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｅｓ，　２００４，２０（３）：４２１—４２３．　［６］李洁，刘宝印，ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ　Ｈ，等．中国妇女宫颈癌组织中人乳　头瘤病毒感染及其地理分布的调查［Ｊ］．中华实验和临床病毒学　杂志，１９９６，１０（１）：５０—５５．　［７］李光富，张兆松，王勇，等．日本血吸虫重组２８ＧＳＴ　Ｔ细胞表　位谱的预测及鉴定［Ｊ］．细胞与分子免疫学杂志，２００４，２０（３）：　３５２—３５５．