PLA纤维毡对HCT-8细胞毒性试验

2024-07-29 作者:

吉林医学２０１２年３月第３３卷第７期　・１３５１・　ＰＬＡ纤维毡对ＨＣＴ一８细胞毒性试验　张佳宇。，刘铜军　，王玲玲　，景遐斌　，柳４．吉林大学中日联谊医院康复科，吉林吉林大学中日联谊医院结直肠肛门外科，吉林实　，张玉成　，于慧秋　（１．　长春　１３００２１；２吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林长春长春１３００３３）　１３００２１；３　中国科学院长春应用化学研究所，吉林长春　１３００２２；　［摘要】　目的：探讨不承载任何药物的空白ＰＬＡ纤维毡对人结肠癌细胞ＨＣＴ一８毒性作用。方法：以聚乳酸（ＰＬＡ）作为　载体材料，使用电纺丝技术制备成纤维毡（不加任何药物），采用ＭＴＦ法检测ＰＬＡ纤维毡提侵液是否对ＨＣＴ一８有毒性作用，流式　细胞术对其进行细胞周期分析，倒置显微镜观察细胞形态学变化。结果：不承载任何药物的空白ＰＬＡ纤维毡提侵液作用细胞４８　ｈ　后，呈０级和１级毒性，流式细胞术表明，加入空白ＰＬＡ纤维毡提侵液细胞与对比组的细胞在Ｇ。／Ｇ　期、Ｓ期、Ｇ　／Ｍ期均无明显差　异。倒置显微镜下观察，加入空白ＰＬＡ纤维毡提侵液细胞与对比组的细胞元差异，细胞状态良好，生长旺盛。　［关键词］　聚乳酸（ＰＬＡ）；人结肠癌细胞（ＨＣＴ一８）　静电纺丝是一种利用静电力作为牵引力使高聚物溶液或　熔融体产生喷射形成纤维的技术。纤维直径一般在几十纳米　至几微米之间。由于其设备简单，易于操作，形成的纤维毡孔　隙率高，比表面积大，纤维长径比大，均一性好，目前已成为制　备超微细纳米纤维的热点，在功能材料领域具有广阔的应用　前景聚乳酸（ＰＬＡ）是近年来世界上研究最活跃的生物可降解　高分子材料之一，在生物体内可逐渐完全降解为二氧化碳和　水，具有良好的生物相容性，对人体无毒，在医学领域得到广　泛应用。运用电纺丝技术，在对聚乳酸（ＰＬＡ）进行电纺丝的　同时实现对药物的搭载，就可以将三者有机的结合到一起，有　１．２．２　ＭＴＴ法测定ＰＬＡ纤维毡对ＨＣＴ一８的毒性将培育好　图１纤维毡形状　望解决在药物控制释放体系通常存在的载药量低及药物突释　等问题，从而显示出无穷的发展潜力。　１材料与方法　的人大肠癌（ＨＣＴ一８），消化、吹打制成细胞悬液，进行细胞计　数（用细胞计数板，公式是：细胞数＝４个大格总数／４×１０　×　稀释倍数）。用ＤＭＥＭ将细胞悬液浓度调整到２×１０　个／　ｍｌ。加入细胞培养板９６孔板内，每孔加入２００　，此时每孔的　细胞数为４　０００个。放人孵育箱内。细胞接种后２４　ｈ观察细　胞已贴壁，吸出原细胞培养液，取出７２　ｈ的提侵液，加入孔板　１．１　材料：不含任何药物的ＰＬＡ空白纤维毡，由中科院长春　应用化学研究所提供。人结肠癌细胞ＨＣＴ一８由吉林大学中　日联谊医院杜珍武教授惠赠；另有十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ，上　海英鹏化学试剂公司），四甲基偶氮唑盐（ＭＴｒ，美国Ｓｉｇｍａ公　司），ＤＭＥＭ高糖培养基（美国Ｇｉｂｅｏ公司），乙腈（色谱纯上　内。分成三组，Ａ组：６　ｃｍ　／ｍｌ纤维毡提侵液；Ｂ组：０．５　ｃｍ　／　ｒｎｌ提侵液；Ｃ组：正常细胞培养基。用细胞培养液ＤＭＥＭ将　Ａ、Ｂ两组分别稀释成１００％、５０％、２５％三个小组，孵育４８　ｈ　后，进行ＭＴＩ＂。向每孔加入５　ｍｇ／ｍｌ的ＭＴｒ溶液２０　，放人　海市复旦化学品厂），ＣＯ　孵箱（Ｈｅｒａｅｕｓ　ＢＢ５０６０），倒置相差　显微镜（ＮｉＫｏｎ　ＥＣＬＩＰＳＥ　ＴＥ２０００２Ｕ）（ＮｉＫｏｎＤｉｇｉｔａｌ　ｃａｍｅｒａ　ＤＸＭ１２００Ｆ），自动酶标读数仪（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＭＫ３），高效　孵箱孵育４　ｈ，加入ＤＭＳＯ　１５０　，震荡１０　ｍｉｎ，至甲瓒完全溶　解，在酶标仪４９０波长处测定吸光度值（ＯＤ值），计算细胞增　值率（公式：ＲＧＲ＝实验组ＯＤ／对照组ＯＤ　Ｘ　１００％）和抑制率　（公式：ＲＧＲ＝（１一实验组ＯＤ／对照组ＯＤ）Ｘ１００％）。　液相色谱仪（日本ＳＨＩＭＡＤＺＵ），流式细胞仪ＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒ（　美国Ｂ１Ｄ公司）。　１．２　方法　１．２．３　流式细胞仪检测细胞周期：取三个单孔平皿，细胞种　植在５００　０００以上，分成三组，Ａ组：６　ｃｍ　／ｍｌ纤维毡提侵液；Ｂ　１．２．１　制作ＰＬＡ纤维毡提侵液：取２个５Ｏ　ｍ１的广口瓶，常　规刷洗、过酸、高温灭菌。剪取２张纤维毡（图１），紫外线照　组：０．５　ｃｍ　／ｍｌ提侵液；Ｃ组：正常细胞培养基。作用４８　ｈ时　检测，进行流式细胞仪检测细胞周期：当培养皿细胞生长至　射４ｏ　ｍｉｎ后，将其分别放入２个广口瓶内，加入适量ＤＭＥＭ　细胞培养基（含１０％血清），使纤维毡与细胞培养基的比例　为：６　ｃｍ　／ｍｌ和０．５　ｃｍ　／ｍｌ，放人震荡浮箱震荡３　ｄ，制作提侵　液。　基金项目：国家自然科学基金资助课题（５０３７３０４３）　通讯作者：于惠秋　８０％时，消化、吹打制成细胞悬液，１　５００　ｒ／ｍｉｎ离心３　ｒａｉｎ，保　留细胞沉淀，去除上清液，应用０．Ｏ１Ｍ　ＰＢＳ冲洗，１　５００　ｒ／ｒａｉｎ　离心３～５　ｍｉｎ，保留细胞沉淀，去上清。加入１　ｍｌ　７０％乙醇，　轻轻吹打混匀，１　５００　ｒ／ｒａｉｎ离心５　ｒａｉｎ，沉淀细胞，弃上清，加　入１　ｍｌ，０．０１　ＰＢＳ，重悬细胞，１　５００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，沉淀细　胞，弃上清。每管细胞样品中加入０．５　ｍｌ碘化丙啶染色液，缓　・１３５２・　慢并充分重悬细胞沉淀。３７℃避光温浴３０　ｍｉｎ后运用流式细　胞仪进行周期分析，并拍照进行细胞形态学描述。　１．３统计学分析：采用ＳＰＳＳ１０．０软件进行分析。两组间率　的比较用　检验。平，Ｐ＜０．０５认为有统计学有显著性差异。　２结果　２．１　结果显示，４８ｈ时生长率，Ａ组：１００％、５０％对ＨＣＴ一８　呈一级毒性，２５％对细胞呈０级毒性；Ｂ组：１００％、２５％对ＨＣＴ　一８呈一级毒性，５０％对细胞呈０级毒性，表明纤维毡提侵液　对细胞生长增值没有明显影响，具有良好的细胞相容性。（根　据国际细胞毒性分级＜表１＞）Ａ组与Ｂ组比较Ｐ＞０．０５无统　计学意义。见表２。　表１国际毒性反应分级（准则：ＧＢ１９９２—２００３）　生长率（％）　毒性反应分级（级）　≥１０ｏ　７５～９９　５０～７４　２５～４９　１～２４　Ｏ　表２　４８　ｈ　ＰＬＡ纤维毡提侵液对ＨＣＴ一８毒性作用（％）　注：Ａ组、Ｂ组比较：Ｐ＞０．０５无统计学意义　２．２　倒置显微镜观察形态学变化：提侵液作用细胞４８　ｈ后　对细胞形态进行观察，分析结果如下，Ａ组、Ｂ组、Ｃ组细胞贴　壁生长良好，呈梭型或三角形，三组间无明显差异。见图２。　一■一　图２　４８　ｈ提侵液及正常ＤＭＥＭ细胞培养基细胞形态照片　２．３　流式细胞仪分析结果：作用４８　ｈ后运用流式细胞仪对　Ａ、Ｂ、ｃ三组进行细胞周期分析，分析结果如下：加入空白ＰＬＡ．　纤维毡提侵液细胞与对比组的细胞在Ｇｏ／Ｇ。期、ｓ期、Ｇ：／Ｍ　期均无明显差异（Ｐ＞０．０５）（图３为各组代表性细胞周期　图）。　３讨论　占林医学２０１２年３月第３３卷第７期　§　图３流式细胞仪细胞周期分析　静电纺丝是一种利用静电力作为牵引力使高聚物溶液或　熔融体产生喷射形成纤维的技术。纤维直径一般在几十纳米　至几微米之问。由于其设备简单，易于操作，形成的纤维毡孔　隙率高，比表面积大，纤维长径比大，均一性好，目前已成为制　备超微细纳米纤维的热点，在功能材料领域具有广阔的应用　前景聚乳酸属ｄ一聚酯类，在体内降解生成乳酸，是糖的代谢　产物，所以它与组织和细胞具有很好相容性。　本实验采用的聚乳酸材料ＰＬＡ为美国ＦＤＡ批准可应用　于人体的医用降解聚合物，生物相容性好。本实验通过运用　ＭＴＦ法、流式细胞仪对细胞周期的检测与分析证明了ＰＬＡ纤　维毡提侵液与正常ＤＭＥＭ细胞培养基对ＨＣＴ一８培养无明显　差别，ＰＬＡ纤维毡提侵液对ＨＣＴ一８无毒性作用，具有良好的　生物相容性。中国科学院长春应化所与本科合作，采用电纺　丝技术制备载药纤维毡，可以将奥沙利铂、５氟尿嘧啶、紫杉醇　等多种现在临床上应用的一线化疗药物按比例混合制备，简　化了制备工艺，增加了药物的有效担载，同时为不能切除的病　灶及姑息性手术的患者，提供了一种新的治疗方式的尝试途　径。　综上所述，ＰＬＡ纤维毡具有独特的优越性，是一种理想的　控释载体，尤其在临床上广泛应用抗肿瘤的价值更大，我们的　初步研究已经证实了他的安全性和可行性，而且研究成果还　有广泛的适应性，可用于多种药物的剂型改变与满足控制释　放要求，有很好的临床应用前景。　４参考文献　［１］Ｇｒｏｓｅｎ　Ｅ，Ｓｉｉｔ　ａｒｉ　Ｅ，Ｌａ　ｓｏｎ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｐａｌｉｔ　ａｘｅｌｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔ　ｉｖｉｔｙ　ｒｅａｃｔ　ｉｏｎｓ　ｒｅｌ　ａｔ　ｅｄ　ｔｏ　ｂｅｅ２ｓ　ｔｉｎ　ｇ　ａｌｌｅｒｇｙ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，２０００，　３５５（９２００）：２８８．　［２］Ｘｕ　ｘ，Ｙａｎｇ　Ｌ　Ｕｈｒａｉｆｎｅ　ｍｅｄｉｃａｔｅｄ　ｆｉｂｅｒ　ｓｅｌｅｃｔ　ｒｏｓｐｕｎ　ｆｒｏｍ　Ｗ／Ｏ　ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅｌｅａｓｅ，２００５，１０８（１２２）：３３．　［３］　张凯，刘铜军，景遐斌，等．聚乳酸／羟基乙酸胆总管　支架在体外胆汁中的降解［Ｊ］．吉林大学学报・医学版，２００５，　３ｌ（６）：９０９．　［４］章金兵，许明．纳米纤维的研究进展［Ｊ］．江西化工，　２００４，（３）：２４．　［５］　胡平，张璐．电纺丝及其在生物医用材料中的应用　［Ｊ］．纺织科学研究，２００４，１４（２）：２６．　［６］杨清彪，王策．聚丙烯腈纳米纤维的再细化［Ｊ］．高　等学校化学学报，２００４，２５（３）：５８９．　吉林医学２０１２年３月第３３卷第７期　・１３５３・　［７］　Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ　Ｇ，Ｒｅｎｅｋｅｒ　ＤＨ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｓｍａｌｌｄｉａｍｅｔｅｒ　ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ　ａｒａｍｉｄ　ｆｉｂｅｒｓ［Ｊ］．Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｉｎｔｅｍａｔｉｏｎ—　ｌ，ａ１９９５，３６（２）：１９５．　ｂｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｆｏｒ　ｂｏｎｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉｌａｓ，２００３，２４（１１）：２０７７．　［收稿日期：２０１２一Ｏ１—０５编校：郑英善］　［８］Ｙｏｓｋｉｍｏｔｏ　Ｈ，Ｓｈｉｎ　ＹＭ．Ａ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ　ｎａｎｏｉｆｂｅｒ　ｓｃａｆｆｏＭ　・护理研究・　间歇性导尿在神经源性膀胱康复中的应用　徐雪敏，刘晓菲，李洁（宁夏自治区第五人民医院大武口分院神经内科，宁夏银ＪｉＩ　７５００００）　［关键词］　膀胱；神经源性；导尿管插入；康复　对３２例神经源性膀胱患者实施间歇性导尿及配合膀胱　击时宜轻而快，避免重扣，重扣可引起膀胱尿道功能失调；尿　功能康复训练，２个月后能自控排尿或完全控制为叩击或压腹　后排尿的ｌ６例，部分自控的１３例，改善不明显３列。提示神　潴留患者导尿前使用屏气法或手压腹部法协助排尿，患者采　取坐位，放松腹部身体前倾，屏住呼吸，训练患者收缩腹肌，从　经源性膀胱患者通过实施间歇性导尿及配合膀胱功能康复训　练可改善患者的排尿功能，解除患者心理的压力及预防泌尿　而增加膀胱及骨盆部的压力，促进尿液排泄。双手拇指至于　髂嵴处，其余手指放在下腹部膀胱区，用力向盆腔压迫，帮助　排尿。　２结果　系统并发症，有利于患者整体的康复。　１资料与方法　１．１　一般资料：２０１１年６月一２００８年１２月本院住院神经源　性膀胱患者１８例，其中脑卒中８例，尿失禁６例，尿潴留４例，　年龄２１～７８岁。　１．２方法　经间歇性导尿及配合膀胱功能康复训练２个月后１８例　神经源性膀胱患者能自控排尿或完全控制为叩击或压腹后排　尿的占５０％（９／１８），部分自控的占４０．６％（８／１８），排尿障碍　改善不明显的占９．４％（１／１８）。　１．２．１　制定饮水计划：根据患者的个体情况制定饮水计划，　嘱咐患者施行间歇性导尿期问要遵从饮水计划，以免膀胱因　不能排尿而过度膨胀，损伤其功能。饮水计划中饮水量１　５００　—３讨论　尿失禁是脑卒中、脊髓损伤患者最常见的并发症。在康　２　０００　ｍｌ／ｄ，平均１００—１２５　ｍｌ／ｄ，饮水包括所有的流质，如　复过程中，如果患者的排尿障碍得到改善，可以减少患者生活　过程中的身体上及精神上的痛苦，提高患者的生活质量，减轻　患者经济和护理的负担。因此，神经源性膀胱患者在康复过　粥、汤、果汁等。晚上８：ｏ０后尽量不要饮水，避免膀胱夜间过　度膨胀。不要饮利尿饮品。　１．２．２　间歇性导尿问隔时间：开始一般以４～６　ｈ导尿１次为　宜，导尿时间宜安排在起床前、餐前、帅前，每次导尿前半个小　程实施间歇性导尿，可以使膀胱周期性扩张与排空，维持膀胱　近似生理状态，促进膀胱功能的康复，重新训练反射性膀胱。　实施间歇导尿及配合膀胱康复训练期间，还需注意做好患者　的心理护理工作，解除患者的心理障碍；向患者说明间歇性导　尿、膀胱康复训练的重要性，以取得患者合作。其次护士在膀　胱康复驯良前还要了解尿流动力学等情况，以确认膀胱类型　时，让患者试行排尿１次后开始排尿，需测定参与尿，残余尿　量以不超过４００—５００　ｍｌ为宜。以后可以根据排尿回复情况　及排除尿量的多少而作相应的调整，逐渐较少导尿次数，延长　间隔时间，每８小时导尿１次过度到每ｌ２小时导尿１次或每　天仅在睡前导尿１次。当患者能反射性地排出适当的尿量或　耻骨上压腹手法，叩击板击点就能排尿，残余尿量＜１５０　ｍｌ，说　明膀胱已达到平衡，此时间歇性导尿了可停止。实施间歇性　的安全的训练方法，避免因训练方法不当引起尿液反流造成　肾积水。最后导尿必须严格遵守无菌操作规则，经常进行尿　常规监测，以免造成医源性感染。膀胱功能的恢复，与有无感　染及感染的程度有密切的关系。　４参考文献　导尿期间要注意观察因膀胱压力过高而引起的自主神经反射　亢进的临床表现。如突发性血压升高、皮肤潮红、皮肤潮红。　出汗、头痛等反应，如出现应当迅速排空膀胱，缓解症状。　１．２．３　配合膀胱功能康复训练：间歇性导尿期间，根据膀胱　［１］燕铁斌，都祖灵　实用瘫痪康复［Ｍ］．北京：人民卫生　出版，１９９９：３８９．　损伤类型进行膀胱康复训练协助排尿。尿失禁患者导尿前对　排尿板击点进行不同方法的刺激，促进排尿功能的康复，如：　轻轻叩击耻骨上区、牵拉阴毛、摩擦大腿内侧、挤压阴茎、龟头　［２］李书贞，赵曦光　康复护理学［Ｍ］．北京：人民军医出　版社，２００１：１３６．　部、听流水声、热敷下腹部等辅助措施。对排尿板击点进行叩　［收稿日期：２０１１—０７—２８编校：王丽娜／郑英善］