shRNA抑制宫颈癌Hela细胞株HPV18E6、E7基因表达的研究

2024-07-29 作者:

微生物学杂志　２０１２年５月第３２卷第３期ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ　Ｍａｙ　２０１２　Ｖｏ１．３２　Ｎｏ．３　２５　ｓｈＲＮＡ抑制宫颈癌Ｈｅｌａ细胞株　ＨＰＶ１８　Ｅ６、Ｅ７基因表达的研究　王雪莲　，卢　岩　，韦　苇。，杨　雪　，安春丽　（１．中国医科大学基础医学院病原生物学教研室，辽宁沈阳ｌ１０００１；２．中国医科大学附属盛京医院院感科，辽宁沈阳ｉ１０００４；　３．中国医科大学七年制，辽宁沈阳１１０００１）　摘要应用短发夹ＲＮＡ（Ｓｈｏａ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ）表达载体抑制宫颈癌Ｈｅｌａ细胞株ＨＰＶ１８　Ｅ６、Ｅ７基因　的表达。应用已鉴定的ｓｈＲＮＡ表达栽体ｐＨＰＶ１、ｐＨＰＶ２转柒Ｈｅｌａ细胞，Ｇ４１８筛选阳性细胞，建立稳定转染细　胞株；倒置荧光显微镜检测转染情况；提取细胞内总ＲＮＡ，ＲＴ－ＰｅＲ方法检测ＨＰＶＩ８　Ｅ６、Ｅ７　ｍＲＮＡ；Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ检测ＨＰＶ１８　Ｅ６、Ｅ７蛋白表达的变化；采用灰度分析软件对ＰＣＲ扩增条带与蛋白质条带进行灰度分析。　ｐＨＰＶ１实验组细胞内ＨＰＶ１８　Ｅ６、Ｅ７　ｍＲＮＡ含量分别为阴性对照组的３１％、３８％，Ｅ６、Ｅ７蛋白分别为阴性对照　组的３７％、３１％；ｐＨＰＶ２实验组细胞内ＨＰＶ１８　Ｅ６、Ｅ７　ｍＲＮＡ含量分别为阴性对照组的５４％、７７％，Ｅ６、Ｅ７蛋白　分别为阴性对照组的５２％、８３％。ｐＨＰＶ１、ｐＨＰＶ２表达载体能抑制Ｈｅｌａ细胞ＨＰＶ１８　Ｅ６、Ｅ７的表达，针对外显　子区４３４－４５２的ｐＨＰＶ１抑制作用更强。　关键词　短发夹ＲＮＡ；人乳头瘤病毒ｌ８型；Ｅ６基因；Ｅ７基因　中图分类号Ｑ７８６；Ｒ７３７．３３　文献标识码Ａ　文章编号１００５—７０２１（２０１２）０３—００２５—０５　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　１８　Ｅ６，Ｅ７　ｉｎ　Ｈｅｌａ　Ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｓｈＲＮＡ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ＷＡＮＧ　Ｘｕｅ—ｌｉａｎ　，ＬＵ　Ｙａｎ　，ＷＥＩ　Ｗｅｉ　。ＹＡＮＧ　ＸＨｅ　，ＡＮ　Ｃｈｕｎ．１ｉ　（１．Ｔｅａｃｈ．＆Ｒｅｓ．Ｄｉｖ．ｏｆＰａｔｈｏｇ．Ｂｉｏ１．，ＣｏＵ．ｏｆＢａｓｉｃ　Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，Ｃｈｉｎａ　Ｍｅｄ．Ｕｎｉ．，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００１；　２．Ｄｅｐｔ．ｏｆＩｎｆｅｃｔ．Ｃｔｒｌ，Ａｆｉｆｌ．Ｓｈｅｎｇｆｉｎｇ　Ｈｏｓｐ．，Ｃｈｉｎａ　Ｍｅｄ．Ｕｎｉ．，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００４；　３．７－ｙｅａｒ’ｓ　Ｓｃｈ１．，Ｃｈｉｎａ　Ｍｅｄ．Ｕｎｉ．，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　Ｉ　１０００１）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　ｓｈ０ｎ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ＨＰＶ（ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）　１８　ｔｙｐｅ　Ｅ６，Ｅ７　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｈｅｌａ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ　ｓｈＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｐＨＰＶ１　ａｎｄ　ｐＨＰＶ２　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｈｅｌａ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｂｙ　Ｇ４１８　ａｎｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｓｔａｂｌｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｅｅｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｉｎｓｉｄｅ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ａｎｄ　ＨＰＶ　１　８　Ｅ６，Ｅ７　ｍＲＮＡ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ．Ｇｒａｙ　ｓｃａｌｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇｒａｙ　ｓｃａｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｂａｎｄｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂａｎｄｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ＨＰＶ１８　Ｅ６．Ｅ７　ｍＲＮＡ　ｉｎｓｉｄｅ　ｃｅｌｌ　ｏｆ　ｐＨＰＶ１　ｔｅｓｔｅｄ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｐｅｃ—　ｔｉｖｅｌｙ　３１％，３８％ｏｆ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ　Ｅ６，Ｅ７　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　３７％，３１％ｏｆ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ＨＰＶ１８　Ｅ６，Ｅ７　ｍＲＮＡ　ｉｎｓｉｄｅ　ｃｅｌｌ　ｏｆ　ｐＨＰＶ２　ｔｅｓｔｅｄ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　５４％，７７％ｏｆ　ｎｅｇａ—　ｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ　ＨＰＶ　Ｅ６，Ｅ７　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｅｒｅ　５２％，８３％ｏｆ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｓｈＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓ—　ｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｐＨＰＶ１，ｐＨＰＶ２　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｌａ　ｃｅｌｌ　ＨＰＶ　Ｅ６　ａｎｄ　Ｅ７　ｇｅｎｅ．ｐＨＰＶ１　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　基金项目：国家自然科学基金（８ｌ１０１９８９）；辽宁省教育厅科研项目（Ｌ２０１０５７９）；　教育部留学回国人员科研启动基金（教外司留［２０１０］１１７４号）　作者简介：王雪莲女，副教授。现从事人乳头瘤病毒相关疾病的基因及免疫治疗研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｒｄｃｍｕ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ　收稿日期：２０１２－０２—１２；修回１３期：２０１２－０４－０２　微生物学杂志　ＨＰＶ１　ａｉｍｉｎｇ　ａｔ　ｅｘｔｒｏｎ　４３４４５２　ｗａｓ　ｅｖｅｎ　ｓｔｒｏｎｇｅｒ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ；ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　１　８　ｔｙｐｅ：Ｅ６　ｇｅｎｅ；Ｅ７　ｇｅｎｅ　ＲＮＡｉ（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）技术是近年迅速发　展起来的新型基因阻断技术，已经被广泛应用于　物：５　－ＡＡＡ　ＴＣＧ　ＴＧＣ　ＧＴＧ　ＡＣＡ　１ｖｒＡ　Ａ一３　，下游引　物：５　－ＣＴＣ　ＧＴＣ　ＡＴＡ　ＣＴＣ　ＣＴＧ　ＣＴＴ　Ｇ．３　。　１．２　方法　包括人类免疫缺陷病毒　、乙型肝炎病毒　及　人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌａｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）　等　病毒的基因功能和病毒性疾病以及病毒相关肿瘤　１．２．１　Ｈｅｌａ细胞常规培养传代用含１０％血清　的ＲＰＭＩ．１６４０常规培养Ｈｅｌａ细胞。　的基因治疗研究。与直接导入小干扰ＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）和体外转录的ｓｉＲＮＡ相　比，短发夹ＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ）表达　载体更易导入细胞内，带有抗生素标记的ｓｈＲＮＡ　表达载体经过筛选可建立稳定转染的细胞株，能　够更长时间地抑制目的基因的表达。而且表达载　体可在细胞内进行复制扩增，不需要直接操作　ＲＮＡ，较少量的ｓｈＲＮＡ表达载体就能产生良好的　抑制效果。本研究前期试验结果证实了化学合成　的ｓｉＲＮＡ可有效地抑制宫颈癌Ｈｅｌａ细胞株　ＨＰＶ１８　Ｅ６、Ｅ７基因的表达　。　，为了进一步长期而　有效地抑制ＨＰＶ１８癌基因Ｅ６、Ｅ７表达，构建、鉴　定了含ＲＮＡ　ｐｏｌⅢ的ｓｈＲＮＡ表达载体ｐＨＰＶ　，　建立稳定转染表达载体的细胞株，观察此细胞株　ＨＰＶ　Ｅ６、Ｅ７基因表达的变化，为建立以ＨＰＶ癌　基因为靶标的宫颈癌基因治疗研究奠定基础。　１　材料与方法　１．１　材料　含ＲＮＡ　ｐ０ｌⅢ的ｓｈＲＮＡ表达载体ｐＨＰＶ　（携带Ｇ４１８抗性和ＧＦＰ标记，靶序列为基因组　４３４—４５２和基因组２８７—３０５）、无关序列对照载　体和宫颈癌Ｈｅｌａ细胞株由本教研室保存；ＲＰＭＩ－　１６４０、Ｇ４１８为美国Ｓｉｇｍａ公司产品；胎牛血清、胰　蛋白酶购自北京中杉有限公司；梭华．Ｓｏｆａｓｔ　转染　剂购自厦门太阳马生物工程有限公司；Ｔｒｉｚｏｌ和　ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒购自ＴａＫａＲａ公司；ＨＰＶ１８一Ｅ６、　Ｅ７、Ｂ－ａｃｔｉｎ抗体及二抗均购自Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司；　ＨＰＶ１８．Ｅ６、Ｅ７、Ｂ－ａｃｔｉｎ引物由大连宝生物公司合　成，序列如下：ＨＰＶ１８　Ｅ６：上游引物：５　－ＡＡＧ　ＡＴＴ　ＴＡＴ　ＴＴＧ　ＴＧＧ　ＴＧＴ－３　，下游引物：５　．ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＴＴＣ　ＡＡＣ　ＧＧＴ　ＴＴＣ－３　；ＨＰＶ１８　Ｅ７：上游引物：５　－　ＴＡＴ　ＧＣＡ　ＴＧＧ　ＡＣＣ　ＴＡＡ　ＧＧＣ一３　，下游引物：５　－　ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＣＴＴ　ＡＣＴ一３　；Ｂ．ａｅｔｉｎ：上游引　１．２．２表达载体ｐＨＰＶ转染细胞转染前１８　ｈ，　每孔接种３×１０　Ｈｅｌａ细胞。２　ｇ质粒载体稀释于　１００　Ｌ不含血清和抗生素的ＲＰＭＩ．１６４０中，轻轻混　匀。４．５　Ｌ转染剂稀释于１００　Ｌ不含血清和抗生　素的ＲＰＭＩ－１６４０中，轻轻混匀。１００　ｌｘＬ转染剂稀释　液滴加到载体稀释液中，一边滴加一边混匀。室温　孵育２０　ｍｉｎ。２００　Ｌ转染剂／载体复合物加到每孑Ｌ　中并轻轻摇动，均匀混合。置３７℃培养箱中培养。　同时设阴性对照和无关序列对照组。　１．２．３转染后阳性细胞的筛选转染后４８　ｈ，用　含１　０００　ｇ／ｍＬ　Ｇ４１８的ＲＰＭＩ一１６４０筛选，２—４　ｄ　换液１次。Ｇ４１８筛选１０—１４　ｄ后可见阳性克　隆，挑取阳性克隆，转移至新的培养板中，继续　Ｇ４１８（４００　ｇ／ｍＬ）筛选扩大培养。倒置荧光显微　镜下观察。取转染后细胞进行ｍＲＮＡ、蛋白检测　分析。　１．２．４细胞总ＲＮＡ提取ＴＲＩＺＯＬ常规提取细　胞总ＲＮＡ。　１．２．５　ＲＴ－ＰＣＲ检测细胞中ＨＰＶ１８　Ｅ６、Ｅ７　ｍＲＮＡ取ＲＮＡ逆转录为ｅＤＮＡ。逆转录反应体　系如下：ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　ｄＨ２Ｏ　７．５　Ｌ、ＭｇＣ１２　４　Ｌ、１０　×ＲＴ—Ｂｕｆｆｅｒ　２　ｔｘＬ、ｄＮＴＰ（各１０　ｍｍｏｌ／Ｌ）２　ＩｘＬ、　ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０　Ｕ／ＩｘＬ）０．５　Ｌ、Ｒａｎｄｏｍ　９　ｍｅｒｓ　（５０　ｐｍｏｌ／￣Ｌ）１　Ｌ、ＲＮＡ　１　０００　ｎｇ、ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｅｒｉｐｔａｓｅ（５　Ｕ／　Ｌ）１　ＩｘＬ，总体积为２０　Ｌ。反　应程序如下：３０　ｏＩ＝１０　ｍｉｎ，４２℃３０　ｍｉｎ，９９℃５　ｍｉｎ，５℃５　ｍｉｎ。ＰＣＲ反应体系如下：无菌双蒸水　５　Ｌ、５×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　５　Ｌ、Ｅｘ　Ｔａｑ　ＨＳ（５　Ｕ／￣ｔＬ）０．　１２５　ｔｚＬ、Ｅ６、Ｅ７、Ｂ—ａｅｔｉｎ上下游引物（２　Ｉｘｍｏｉ／Ｌ）各　２．５　Ｌ、逆转录ｅＤＮＡ　５　ＩｘＬ，总体积为２０　Ｌ。反　应程序如下：Ｅ６：９４℃５　ｍｉｎ，９４　ｃ【＝３０　Ｓ，６１℃３０　Ｓ，７２℃３０　Ｓ，３５个循环，７２　ｃｌ：１０　ｍｉｎ。Ｅ７：９４℃　５　ｍｉｎ，９４℃３０　Ｓ，５２℃３０　Ｓ，７２℃３０　Ｓ，３５个循　环，７２℃１０　ｍｉｎ。Ｂ．ａｅｔｉｎ：９４℃５　ｍｉｎ，９４　ｃｃ　３０　２８　微生物学杂志　２．３　ｐＨＰＶ对Ｈｅｌａ细胞内ＨＰＶ　Ｅ６、Ｅ７蛋白的　ｍＲＮＡ为双顺反子ｍＲＮＡ，在Ｅ６　ＯＲＦ有一个内含　影响　子。如内含子被剪切，则形成Ｅ６Ｅ７　ｍＲＮＡ，表达　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ结果显示，ｐＨＰＶ１实验组ＨＰＶ　Ｅ６和Ｅ７蛋白。内含子的剪切破坏Ｅ６　ＯＲＦ，使全　Ｅ６、Ｅ７蛋白条带灰度低于阴性对照组和无关序列　长Ｅ６蛋白表达受阻　ｉｔ－ｔ２］。　组；ｐＨＰＶ２实验组ＨＰＶ　Ｅ６蛋白条带灰度低于阴　研究证实，在宫颈癌Ｃａｓｋｉ及Ｈｅｌａ细胞内，　性对照组和无关序列组，ＨＰＶ　Ｅ７蛋白条带与阴　ＨＰＶ　Ｅ６Ｅ７　ｐｒｅ－ｍＲＮＡ存在不同位置和不同程度　性对照组和无关序列组相比，没有明显降低；各组　的剪切。其中，Ｈｅｌａ细胞ＨＰＶ１８　Ｅ６Ｅ７　ｐｒｅ－ｍＲＮＡ　ＡＣＴＩＮ蛋白条带灰度基本一致（图３）。　在ｎｔ２３３　５　ＳＳ、ｎｔ４１６　３　ＳＳ剪切¨　。本研究分别针　２　对Ｅ６外显子和内含子区域设计ｓｈＲＮＡ，靶序列　分别为基因组４３４—４５２和基因组２８７—３０５，成　功构建ｓｈＲＮＡ表达载体ｐＨＰＶ１、ｐＨＰＶ２，并获得　了稳定转染的Ｈｅｌａ细胞株，结果显示ｐＨＰＶ１可　降低Ｈｅｌａ细胞ＨＰＶ　Ｅ６、Ｅ７　ｍＲＮＡ水平，ｐＨＰＶ２　仅明显降低细胞ＨＰＶ　Ｅ６　ｍＲＮＡ的水平，而对细　２　胞内ＨＰＶ　Ｅ７　ｍＲＮＡ的影响较小。分析原因可能　一为针对外显子区域ｐＨＰＶ１不仅可降解全长的　Ｅ６、Ｅ７　ｍＲＮＡ，而且也可降解内含子剪切后形成　Ｅ６　　的Ｅ６、Ｅ７　ｍＲＮＡ。由于Ｅ６Ｅ７　ｍＲＮＡ没有内含　１　２　３　４　子，因而针对内含子区域ｐＨＰＶ２只能降解全长的　糊　蝴　瓣穆锵　Ｅ６、Ｅ７　ｍＲＮＡ，对Ｅ６Ｅ７　ｍＲＮＡ没有影响。但Ｔａｎｇ　等¨　发现内含子特异ｓｉＲＮＡ２１９降解Ｈｅｌａ细胞　Ｅ６Ｅ７　ｍＲＮＡ，因而认为ｓｉＲＮＡ降解发生在核内　图３　ｐＨＰＶ对细胞内ＨＰＶ　Ｅ６、Ｅ７蛋白的影响　ＲＮＡ剪切之前，即ｐｒｅ．ｍＲＮＡ水平。本研究中针　Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐＨＰＶ　Ｏｉｌ　ＨＰＶ　Ｅ６　ｐｒｏｔｅｉｎ　对内含子区域（基因组２８７—３０５）的ｐＨＰＶ２是否　１：阴性对照组；２：无关序列组；３：ｐＨＰＶ１实验组；　４：ｐＨＰＶ２实验组　能够同样降解Ｅ６Ｅ７　ｍＲＮＡ尚需要进一步证实。　１：ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；２：ｎｏｎｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；３：ｐＨＰＶ１　由于ＨＰＶ１８　Ｅ６　ＯＲＦ的终止密码子与下游　ｇｒｏｕｐ；４：ｐＨＰＶ２　ｇｒｏｕｐ　Ｅ７　ＯＲＦ起始密码子之间只有８　ｎｔ的距离，核糖　计算机采图，灰度分析软件分析灰度，以阴性　体终止Ｅ６　ＯＲＦ后不足以使核糖体有效再起始　对照组Ｅ６、Ｅ７与ＡＣＴＩＮ的灰度比为１００％，其他　Ｅ７　ＯＲＦ的翻译，因而未剪切Ｅ６Ｅ７　ｍＲＮＡ主要形　各组与阴性对照组相比较。结果显示，无关序列　成的是Ｅ６蛋白，而不是Ｅ７。而剪切的Ｅ６、Ｅ７　对照组ＨＰＶ　Ｅ６、Ｅ７蛋白含量分别为阴性对照组　ｍＲＮＡ由于内含子的剪切，阅读框架发生了改变，　的１０６％、９７％；ｐＨＰＶ１实验组ＨＰＶ　Ｅ６、Ｅ７蛋白　提前出现了终止密码子，因而增加了Ｅ６　ＯＲＦ与　含量分别为阴性对照组的３７％、３１％；ｐＨＰＶ２实　Ｅ７　ＯＲＦ的距离，使得核糖体有足够的距离再起　验组ＨＰＶ　Ｅ６、Ｅ７蛋白含量分别为阴性对照组的　始Ｅ７的翻译。最近Ｔａｎｇ等¨　研究显示ＨＰＶ１６、　５２％、８３％。　１８　Ｅ７蛋白主要是由剪切的Ｅ６Ｅ７　ｍＲＮＡ以翻译　３　讨　论　终止．再起始的方式翻译形成的。本研究结果显　示，ｐＨＰＶ１可降低Ｈｅｌａ细胞内的ＨＰＶ　Ｅ６及Ｅ７　ＨＰＶ１８基因组包含２个启动子，Ｐ１０５是早期　蛋白，分析原因为针对外显子区的ｐＨＰＶ１既可降　启动子，在Ｅ６　ＯＲＦ上游，启动基因组早期基因的　解形成Ｅ６蛋白的Ｅ、６Ｅ７　ｍＲＮＡ，又可降解形成　转录　引。几乎所有的乳头瘤病毒转录产物为双　Ｅ６和Ｅ７蛋白的Ｅ６Ｅ７　ｍＲＮＡ，由于ｐＨＰＶ２不能　顺反子或多顺反子¨　，包含多个外显子和内含　降解形成Ｅ７蛋白的Ｅ６Ｅ７　ｍＲＮＡ，因而仅对Ｅ６　子。其中ＨＰＶＩ８　Ｅ６、Ｅ７基因的早期转录本ｐｒｅ—　蛋白有明显的降低，而对Ｅ７蛋白含量影响较小。　３期　王雪莲等：ｓｈＲＮＡ抑制宫颈癌Ｈｅｌａ细胞株ＨＰＶ１８　Ｅ６、Ｅ７基因表达的研究　２９　参考文献：　Ｈｕｅｌｓｍａｎｎ　ＰＭ，Ｒａｕｃｈ　Ｐ，Ａｌｌｅｒｓ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｒｕｇ－　［８］　Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ—Ｇａｄｉｃｋｅ　Ａ，Ｓｃｈｗａｒｚ　Ｅ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｓｈｏｗ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ｈｕ－　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ＨＩＶ－１　ｂｙ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ［Ｊ］．Ａｎｔｉ　ｖｉｒａｌ　Ｒｅｓ，２００６，　６９（１）：１－８．　ｍａｌｌ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｕｓｒ　ｔｙｐｅ　１８　ｅａｒｌｙ　ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＥＭＢＯ，１９８６，５　（９）：２２８５－２２９２．　［９］Ｒｏｍａｎｃｚｕｋ　Ｈ，Ｔｈｉｅｒｒｙ　Ｆ，Ｈｏｗｌｅｙ　ＰＭ．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃｉｓ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　Ｅ２　ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　［２］　Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　ＨＳ，Ｄａｈｅｒ　Ａ，Ｓｏｙｅ　ＫＪ，ｅｔ　ａ１．ｓｉＲＮＡｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　ＴＡＲ　ＲＮＡ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＴＲＢＰ，ａ　Ｄｉｃｅｒ　ｃｏｆａｃｔｏｒ，ｉｎｈｉｂｉｔ　ＨＩＶ－１　ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａ　ｒｅｐｅａｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｖｉｒａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．　Ｊ　Ｖｉｅｒｌ，２００７，８１（１０）：５１２１－５１３１．　ｔｙｐｅ　１６　Ｐ９７　ａｎｄ　ｔｙｐｅ　１８　Ｐ１０５　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｏｌ，１９９０，６４　ｒ（６）：２８４９－２８５９．　［１Ｏ］Ｂａｋｅｒ　ＣＣ，Ｃａｌｅｆ　ｃ．Ｍａｐｓ　ｏｆ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ｍＲＮＡ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ．　［３］　Ｓｕｎ　Ｙ，Ｌｉ　Ｚ，Ｌｉ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉ—　Ｉｎ：Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｉｔｏｒ．“Ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌ－　ｒｕｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｌｏｍａｖｉｍｓｅｓ　ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ”［Ｊ］．Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏ—　ｆｏａｍｙ　ｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｍｅｄ，２００７，１９（４）：７０５－７１１．　ｙｒ，１９９５．　［４］　Ｗｅｉｎｂｅｒｇ　ＭＳ，Ｅｌｙ　Ａ，Ｂａｒｉｃｈｉｅｖｙ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　［１１］Ｚｈｅｎｇ　ＺＭ，ＴａｏＭ，Ｙａｍａｎｅｇｉ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｏｆ　ａ　Ｃａｐ—ｐｒｏｘ－　ｏｆ　ＨＢＶ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｗｉｔｈ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｌｏｎｇ　ｈａｉｒ－　ｉｍａｌ’Ｈｕｍａｎ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　１６　Ｅ６Ｅ７　Ｉｎｔａｒｎ　Ｐｒｏｍｏｔｅｓ　Ｅ７　Ｅｘ・　ｐｉｎ　ＲＮＡ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｔｈｏｒ。２００７，１５（３）：５３４－５４１．　ｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｂｕｔ　ｃａｎ　ｂｅ　Ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ　ｂｙ　Ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｒｏｎ　ｆｒｏｍ　［５］　Ｇｕ　Ｗ，Ｐｕｔｒａｌ　Ｌ，Ｈｅｎｇｓｔ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｉｔｓ　ＲＮＡ　５　Ｃａｐ［Ｊ］．Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２００４，３３７（５）：１０９１－１１０８．　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｗｉｔｈ　ｈｎｔｉｖｉｒａｌ—ｖｅｃｔｏｒ　ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ　ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　Ｅ６　ａｎｄ　Ｅ７　［１２］Ｔａｎｇ　Ｓ，Ｔａｏ　Ｍ，Ｐｈｙｌｉｐ　ＭｃＣｏｙ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　Ｅ７　ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｓｐｌｉｃｅｄ　Ｅ６・Ｉ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　ｉｎ　ｈｉｇｌＩ　ｒｉｓｋ　ｈｕｍａｎ　ｏｎｃｏｇｅｎｃｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ，２００６，１３（１　１）：１０２３－１０３２．　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１６－ｏｒ　１８一ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　［６］　王雪莲，逯晓波，安春丽，等．小干扰ＲＮＡ抑制宫颈癌Ｈｅｌａ　细胞株ＨＰＶ１８　Ｅ６、Ｅ７基因的表达［Ｊ］．中国肿瘤生物治疗　ｖｉａ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｒｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｍｌ，２００６，８Ｏ（９）：４２４９．　４２６３．　杂志，２００７，１４（６）：５４５－５４９．　［１３］Ｚｈｅｎｇ　ＺＭ，Ｂａｋｅｒ　ＣＣ．Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ｅｘ．　［７］　王雪莲，王冬冬，安春丽，等．靶向ＨＰＶ１８　Ｅ６、Ｅ７基因发夹　ｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ　ｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔ　Ｂｉｏｓｃｉ，　状ＲＮＡ表达载体的构建及鉴定［Ｊ］．中国病原生物学杂志，　２００６。１　１：２２８６－２３０２．　２０１０，５（１）：１－５．　本刊声明　为适应信息化建设需要，实现科技期刊编辑、出版发行工作的电子化，推进科技信息　交流的网络化进程，扩大广大作者学术交流渠道，《微生物学杂志》已加入《中国学术期刊　（光盘版）》并入网“万方数据一数字化期刊群”。凡被本刊录用的文章均统一纳入“万方　数据一数字化期刊群”，进入因特网提供信息服务。如作者不同意转让光盘版和网络版．　请另投他刊。本刊所付稿酬包含刊物内容上网服务报酬，不再另付。