hIL-18基因真核表达载体的构建及序列分析

2024-07-29 作者:

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动物医学进展。２００７，２８（９）：４５—４８　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｈｌＬ一１　８基因真核表达载体的构建及序列分析　纪丽丽　，杨玉英　，李士泽　（１．山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊２６１０６１；２．黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆１６３３１９）　摘　要：在获得人白细胞介素１８（ｈＩＬ－１８）基因重组质粒ｐＧＥＭ—Ｔ—ｈＩＬ一１８的基础上，用＆０Ｒ　Ｉ、Ｓａｌ　Ｉ　双酶切该质粒，回收小片段ｈＩＬ－１８基因；同时双酶切真核表达质粒ｐＥＣＦＰ—Ｃ１，回收大片段，二者连接转化　大肠埃希茵感受态细胞。对重组质粒ｐＥＣＦＰ—ｃ１一ｈＩＬ＿１８进行ＰＣＲ扩增、酶切鉴定及序列测定，测序结果表　明，克隆至ｐＧＥＭ—Ｔ中的ＩＬ一１８　ｃＤＮＡ包含成熟ＩＬ一１８的全部编码序列。本研究获得了融合有报告基因　ｐＥＣＦＰ—Ｃ１的真核表达载体，为下一步进行ｈｌＬ－１８在真核细胞中的表达打下了良好的基础，亦为在基因水　平上探讨ｈＩＬ’１８的生物学功能提供了物质基础。　关键词：白细胞介素１８；真核载体；序列测定　中图分类号：Ｑ７８　文献标识码：Ａ　文章编号：１００７—５０３８（２００７）０９—００４５—０４　人白细胞介素１８（ｈＩＬ＿１８）是１９９６年由日本研　生理平衡具有重要意义。因此，其研究一直受到高　究者Ｕｓｈｉｏ　Ｓ等［１］从正常人肝细胞ｃＤＮＡ文库得到　度重视。　人ＩＧＩＦ基因克隆，而将其正式命名的。ｈＩＬ．１８基　真核表达载体选用报告基因ｐＥＣＦＰ—Ｃ１。　因编码１９３个氨基酸前体蛋白，与小鼠ＩＬ一１８（ｍＩＬ－　ｐＥＣＦＰ—Ｃ１作为报告基因具有直观、及时、应用范围　１８）有６５％同源性，Ｎ端也有类似的信号序列，亦无　广的特点，因而在基因重组、蛋白定位及转基因动物　Ｎ端糖基化位点和亲水信号肽位点。其Ｎ端有３６　研究中优于其他报告基因。靶蛋白与ＧＦＰ融合后　个氨基酸前导序列，在ＩＬ一１Ｂ转换酶（ＩＣＥ）酶切下，　可以发挥其跟踪、定位作用，对于新型靶蛋白的功能　成为含１５７个氨基酸残基的成熟有活性的蛋白，分　分析更为必要，在基因治疗和蛋白组学研究领域意　子质量为１８　ｋｕＥ引。ｈＩＬ－１８作为机体内细胞之间相　义重大　－４］。本研究将ｈＩＬ－１８基因插入报告基因　互作用的主要介质，在机体的免疫应答、炎症反应、　ｐＥＣＦＰ—Ｃ１的多克隆位点ＥｃｏＲ　Ｉ和Ｓａｌ　Ｉ之间，为　造血功能、胚胎发育及机体的生长发育等各个方面　探讨ｈＩＬ－１８基因在真核系统中的表达及应用奠定　都起重要作用。同时细胞因子的分泌和释放以及它　基础。　们之间的相互作用，对机体抵御疾病和维持正常的　收稿日期：２００７—０３－３０　基金项目：黑龙江省教育厅科研项目（１０５４１１５７）　作者简介：纪丽丽（１９７８一）．女．山东莱阳人．助教．硕士，主要从事动物生理学及分子生物学研究。＊通讯作者　《杀料料料　带带＊｝诺＊｝诺豢谁　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｈｉｇｈ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｐｉｇｌｅｔ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＺＨＡＮＧ　Ｘｉ—ｆｅｎ　．ＹＡＮＧ　Ｚｅｎｇ—ｑｉ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＡｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ，７１２１００，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｙａｎｇｌｉｎｇ　ＬｖＪａｎｇ　Ｂｉｏ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｏ．ＬＴＤ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ，７１２１００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｅｖｅｒａｌ　ｂａｔｃｈｅｓ　Ｐｉｇｌｅｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｏ２，Ｏ８，０１３５，Ｏ１３８，０１３９，０１４１　ｓｅｒｏｔｙｐｅ）ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｉｎ　５　ｌｉｔｅｒｓ　Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ．Ｔｈｅ　ｂａｓｉｃ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨ，ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ａｎｄ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｐｌａｔｉｎｇ　ｃｏｕｎｔ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　Ｐｉｇｌｅｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｇｒｏｗ　ｂｅｓｔ　ｉｎ　ｒｏｕｔｉｎｅ　ｐｏｗｅｒ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ　ａｔ　３７℃±０．５℃，ｐＨ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　７．０～７．２，ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ，ａｄｄ　４０　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｐＨ，ｔｈｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍ　ｕｎｉｔ（ｃｆｕ）ｏｆ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｃａｎ　ｒｅａｃｈ　１５０　ｈｕｎｄｒｅｄ　ｍｉｌｌｉｏｎ　ｐｅｒ　ｍ１．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　维普资讯

４６　动物医学进展２００７年第２８卷第９期（总第１６８期）　１材料与方法　１．１　材料　１．２．２　重组质粒的ＰＣＲ鉴定　ＰＣＲ反应体系为　２５．０　Ｉ　，其中２×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　１２．５　Ｌ，ｄｄＨ２Ｏ　７．５　Ｌ，ＬＡ　Ｔａｑ（１　Ｕ／ｔ￣Ｌ）０．５　Ｌ，引物ｐ１　（１０　ｐｍｏｌ／ｔ￣Ｉ　）１．０　Ｌ，引物ｐ２（１０　ｐｍｏｌ／￣Ｌ）　１．０　Ｌ，质粒０．５　Ｌ，ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（１０　ｍｍｏｌ／Ｌ）　１．１．１　菌株　大肠埃希菌ＪＭ１０９和大肠埃希菌　ＤＨ５ａ由本实验室保存。　１．１．２质粒ｈｌＬ－１８基因测序质粒ｐＧＥＭ—Ｔ—ｈＩ　Ｌ＿　１８由作者自行构建。ｐＥＣＦＰ—ＣＩ由本实验室保存。　１．１．３　主要试剂　ＥｃｏＲ　Ｉ、Ｓａｌ　Ｉ等限制性内切　酶和Ｔ　ＤＮＡ连接酶等购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司华美生　２．０　Ｌ。反应条件为：９４℃４　ｍｉｎ；９４℃３０　Ｓ，５５℃　４０　ｓ，７２℃６０　ｓ，３０个循环；７２℃延伸１０　ｒａｉｎ。反应　结束后用１０　ｇ／Ｌ的琼脂糖凝胶电泳对ＰＣＲ产物进　物工程公司；ＤＮＡ回收试剂盒（ＤＮＡ　ｇｅｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ）购自杭州维特洁生化技术有限公司。　１．２　方法　１．２．１　ｈＩＬ．１８真核表达载体的构建及筛选鉴定　将构建好的ｈＩＬ一１８基因克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔ－ｈｌＬ－　１８，用ＥｃｏＲ　Ｉ和Ｓａｌ　Ｉ限制酶消化后，利用ＤＮＡ回　收试剂盒回收线性化部分（回收方法按照产品说明　书操作）。回收后，应用１０　ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳观　察。同样，利用ＥｃｏＲ　Ｉ和　Ｚ　Ｉ酶切ｐＥＣＦＰ－Ｃ１，　并回收大片段，将回收到的线性化部分在Ｔ　ＤＮＡ　连接酶的作用下，１６℃过夜连接，连接产物转化大　肠埃希菌ＪＭ１０９感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素　（Ａｍｐ）的ＬＢ平板上，挑选平板上形成的单个菌落，　经ＬＢ液体培养基培养１２　ｈ后，碱裂解法快速提取　质粒，应用ＰＣＲ鉴定，同时限制性内切酶消化后琼　脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。鉴定正确的重组子即　为ｈＩＬ一１８基因ｐＥＣＦＰ－Ｃ１真核表达载体ｐＥＣＦＰ－　Ｃ１一ｈｉＬ－１８。　Ｍ　２　０００　ｂｐ　９２８　８８　５００　ｂｐ　２５０　ｂｐ　ｌ００　ｂｐ　Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ　２　０００ｌ　１．ｐＥＣＦＰ—Ｃ１一ｈＩＬ－１８　ＰＣＲ产物　Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ　２　０００　ｌ　１．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｐＥＣＦＰ－Ｃ１一ｈＩＬ一１８　图１　ｐＥＣＦＰ－Ｃ１一ｈｌＬ－１８　ＰＣＲ鉴定结果　Ｆｉｇ．１　ＰＣＲ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐＥＣＦＰ－Ｃ１一ｈＩＬ－１８　２．３　ｈｌＬ－１８基因序列分析　将ＰＣＲ和酶切鉴定正确的重组质粒送上海生　工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，ｈｌＬ一　１８基因测序结果与原设计序列经ＤＮＡ　Ｓｔａｒ软件分　行鉴定。　１．２．３重组质粒的酶切鉴定　重组阳性克隆质粒　ｐＥＣＦＰ－ＣＩ－ｈｌＬ－１８用ＥｃｏＲ　Ｉ和Ｓａｌ　Ｉ酶切。酶切　反应体系为１０．０　Ｌ，其中阳性克隆质粒５　Ｌ，１０×　Ｈ　ｂｕｆｆｅｒ　２　Ｌ，Ｓａｌ　Ｉ　１　Ｌ，ＥｃｏＲ　Ｉ　１　Ｌ，ｄｄＨ２Ｏ　１　Ｌ。　３７℃恒温水浴２　ｈ，１０　ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳，紫　外灯下观察电泳结果并拍照。　１．２．４序列测定将ＰＣＲ和酶切鉴定正确的重组　质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序　列测定。　２　结果　２．１　重组质粒的ＰＣＲ鉴定　质粒ｐＥＣＦＰ－Ｃ１－ｈｌＬ－１８的ＰＣＲ鉴定结果如图１。　２．２重组质粒的酶切鉴定　质粒ｐＥＣＦＰ—Ｃ１一ｈｌＬ－１８经ＥｃｏＲ　Ｉ和Ｓａｌ　Ｉ进　行双酶切后，出现４　７２１　ｂｐ的线性化片段和４８１　ｂｐ　的目的片段（图２）。　２　ｌ　■　Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ　２　０００　ｌ　１．ｐＥＣＦＰ—Ｃ１一ｈｌＬ－１８双酶切产物　Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ　２　０００　ｌ　１．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｐＥＣＦＰ－Ｃ１一ｈｌＬ－１８　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｂｙ＆ｏＲＩ　ａｎｄＳａＺ　Ｉ　图２　ｐＥＣＦＰ－Ｃ１一ｈＩＬ＿Ｉ８双酶切（段ＤＲ　Ｉ／Ｓａｌ　Ｉ　Ｊ　鉴定结果　Ｆｉｇ．２　＆ｏＲ　Ｉ　ａｎｄ　Ｓａｌ　Ｉ　ｄｉｇｅｓｔ　ｏｆ　ｈＩＬ－１８一ｐＥＣＦＰ－Ｃ１　析，其同源性为９９　。　ｈｌＬ一１８基因测序结果与原设计序列同源性比较　分析结果见图３。　维普资讯

纪丽丽等：ｈＩＬ一１８基因真核表达载体的构建及序列分析　４７　１　ＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣＴＡＡＡＴＴＡＴＣＡＧＴＣＡＴＡＡＧＡＡＡＴＴＴＧＡＡＴＧＡ　５０　５　１　ＣＣＡＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＧＧＣＣＴＣＴＡＴＴＴＧＡＡＧＡＴＡＴＧＡ　１００　５　１　ＣＣＡＡＧＴＴＣＴＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＧＧＣＣＴＣＴＡＴＴＡＧＡＡＧＡＴＡＴＧＡ　１００　１０１　ＣＴＧＡＴＴＣＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＧＡＴＡＡＴＧＣＡＣＣＣＣＧＧＡＣＣＡＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＡ　１５０　ｌ０ｌ　ＣＴＧＡＴＴＣＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＧＡＴＡＡＴＧＣＡＣＣＣＣＧＧＡＣＣＡＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＡ　１５０　１　５　ｌ　ＡＴＧＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＡＡＣＴＡＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡ　２００　１５　ｌ　ＡＴＧＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＡＡＣＴＡＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡ　２００　２Ｏ　ｌ　ＧＴＧＴＧＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＣＴＴＴＡ　２５０　２Ｏ　１　ＧＴＧＴＧＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＣＴＴＴＡ　２５０　２５　１　ＡＧＧＡＡＡＴＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＴＡＣＡＡＡＡＡＧＴＧＡＣＡＴＣＡＴＡ　３００　２５　１　ＡＧＧＡＡＡＴＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＡＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＴＡＣＡＡＡＡＡＧＴＧＡＣＡＴＣＡＴＡ　３００　３Ｏ　１　ＴＴＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＧＡＴＧＣＡＡＴＴＴＧＡＡＴＣ　３５０　３０　ｌ　ＴＴＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＧＡＴＧＣＡＡＴＴＴＧＡＡＴＣ　３５０　３５　１　ＴＴＣＡＴＣＡＴＡＣＧＡＡＧＧＡＴＡＣＴＴＴＣＴＡＧＣＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＣＴＴＴ　４００　３５　ｌ　ＴＴＣＡＴＣＡＴＡＣＧＡＡＧＧＡＴＡＣＴＴＴＣＴＡＧＣＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＣＴＴＴ　４００　４Ｏ　１　ＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＡＴＣＴＡＴＡＡＴＧ　４５０　４０　１　ＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＡＴＣＴＡＴＡＡＴＧ　４５０　４５　１　ＴＴＣＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＣＴＡＧＣＴＡＴ　ＡＡ　４８１　４５　１　ＴＴＣＡＣＴＧＴＴＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＡＣＴＡＧＣＴＡＴＡＡ　４８１　图３　目的基因序列测定结果与ＧｅｎＢａｎｋ中ｈＩＬ－１８基因的同源性比较　Ｆｉｇ．３　Ｈｏｍｏｌｙｓｉｓ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｇｅｎｅｂａｎｋ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＩＬ－１８　３讨论　［３］Ｍｏｒｇａｎ　Ｒ　Ａ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｎ．Ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ａｎｎｕ　由于ＩＬ－１８具有明显的抗肿瘤作用，许多学者进　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９３，６２：１９１－２０４．　行了ＩＬ一１８基因治疗的研究［５≈］。本实验室在前期工　［４］　Ｙａｎｇ　Ｔ　Ｔ，Ｃｈｅｎｇ　Ｌ，Ｋａｉｎ　Ｓ　Ｒ．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ　ａｎｄ　ｅｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　作中克隆到ｈＩＬ一１８成熟蛋白的编码区基因，并在原核　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１９９６，２４　表达系统中获得了高效表达。将所获序列经计算机　（２２）：４５９２—４５９３．　软件分析，所得基因序列内部无ＥｃｏＲＩ和Ｓａｌ　Ｉ酶切位　［５］Ｔａｋｅｄａ　Ｋ，Ｔｓｕｔｓｕｉ　Ｈ，Ｙｎｓｈｉｍｏｔｏ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ＮＫ　ｅｅｌｌ　点，ｐＥＣＦＰ－Ｃ１一ｈＩＬ一１８经上述两种酶切后，不会影响基　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　Ｔｈｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　ＩＬ－１８－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｉ—　因序列编码区的内部结构。虽有几对碱基错配，但其　ｔｙ，１９９８，（８）：３８３—３９０．　［６］Ｗａｎｇ　Ｑ，Ｙｕ　Ｈ，Ｚｈａｎｇ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＩＩ．－１８　ｇｅｎｅ－　氨基酸序列没有发生改变，不影响下一步ＩＬ一１８在真　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ－ｃｏａｔｅｄｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｅｌｉｃｉｔｓ　ｐｏｔｅｎｔ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　核细胞中的表达，表明已完成了ｐＥＣＦＰ－ＣＩ－ｈｌＬ－１８的　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　Ｃｌｌｎ　Ｏｎｃｏｌ，２００１，１２７（】２）：　构建，为下一步的研究奠定了基础。　７１８—７２６．　参考文献：　［７］Ｈｅｇａｒｄｔ　Ｐ，Ｗｉｄｅｇｒｅｎ　Ｂ，Ｌｉ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｉｎ—　［１］Ｕｓｈｉｏ　Ｓ，Ｎａｍｂａ　Ｍ，Ｏｋｕｒａ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｆｏｒ　ｈｉｂｉｔｏｒ　ａｎｄ　ＩＬ－１８　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ—ｇａｍｍａ．ｉｎｄｕｃｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｒａｔｓ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ａｎ　ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕ—　ｃｏｉｌ　ａｎｄ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｊ　ｎｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２００１，５Ｏ（９）：４９卜５Ｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６，１５６：４２７４—４２７９．　［８］纪丽丽，王玉艳，王纯净，等．白细胞介素１８及其生物学作用　［２］纪丽丽，李士泽，杨玉英，等．人白细胞介素１８基因的克隆及序　［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２００５，（１２）：７６－７８．　列测定厂Ｊ］．黑龙江八一农垦大学学报，２００５，１７（５）：６１—６４．　维普资讯

４８　动物医学进展２００７年第２８卷第９期（总第１６８期）　Ｔｈｅ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏ　０ｆ　ｈｉＬ一１　８　Ｇｅｎｅ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ＪＩ　Ｌｉ～ｌｉ　，ＹＡＮＧ　Ｙｕ—ｙｉｎｇ　，ＬＩ　Ｓｈｉ—ｚｅ　（１．Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　０＿，ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗｅｉｆａｎｇ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，２６１０６１，Ｃｈｉｎａ｛　２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ａｕｇｕｓｔ　Ｆｉｒｓｔ　Ｌａｎｄ　Ｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｄａｑｉｎｇ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，１６３３１９，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＧＥＭ—Ｔ—ｈｌＬ一１８　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＧＥＭ—Ｔ—ｈｌＬ－１８　ａｎｄ　ｐＥＣＦＰ—Ｃｌ　ｗａｓ　ｅｎｚｙｍｅｄ　ｂｙ　Ｅ０ｏＲ　Ｉ　ａｎｄ　Ｓａｌ　Ｉ，ｔｈｅｎ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｓｔｒａｉｎ　ＤＨ５ａｔｏ　ｃｏｎ—　ｓｔｒｕｃｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＥＣＦＰ—Ｃｌ—ｈｌＬ一１８．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｐｃｒ，ｅｎｚｙｍｅｄ　ｂｙ　ＥｃｏＲ　Ｉ　ａｎｄ　Ｓａｌ　Ｉ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｃｏｍｐｕｔｅｒ　ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅ—　ｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐＥＣＦＰ—Ｃ１＿ｈＩＬ＿ｌ８　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ａｌｌ　ｔｈｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｍａｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｈｌＬ一１８．Ｗｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｈＩＬ＿ｌ８　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｐＥＣＦＰ—Ｃｌ—ｈｌＬ－１８．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｌａｉｄ　ａ　ｓｏｌｉｄ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｅｘｐｅｒｉ—　ｍｅｎｔａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｕｔｕｒｅ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＩＬ－１８．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１８；ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ；ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　豢＊÷崇崇　崇崇崇矗带崇崇谁崇崇崇崇崇崇崇崇＊÷矗崇崇崇矗崇崇崇崇崇谁豢崇舯崇崇崇崇＊÷　崇诳　崇崇崇崇崇豢崇　黼粜崇崇崇黼∞．一　（上接第４０页）　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｄｙｎａｍｉｃ　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　Ｓｅｒｕｍ　Ｉｎｄｅｘｅｓ　ｉｎ　Ｂｒｅｅｄｅｒ　Ｂｒｏｉｌｅｒ　Ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＲＥＶ　ａｎｄ　ＡＬＶ－Ｊ　ＷＡＮＧ　Ｙｏｎｇ－ｚｈｉ　，ＬＩＵ　Ｃｈｅｎｇ－ｊｕｎ　，ＭＥＮＧ　Ｆａｎ—ｊｕｎ　，ＷＵ　Ｗｅｉ　（１．Ｊｉｎａｎ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｊｉｎａｎ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，２５００２２，Ｃｈｉｎａ　ｌ　２．Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ　Ｐａｓｔｕｒａｇｅ　Ｂｕｒｅａｕ　ｏＪ＂Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，２５２０００，Ｃｈｉｎａ｛　３．ＹｉｓｈｕｉＰａｓｔｕｒａｇｅＢｕｒｅａｕ　ｏｆＳｈａｎｄｏｎｇ，Ｙｉｓｈｕｉ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ．２７６４００，Ｃｈｉｎａ｛　４．Ｗｅｉｆａｎｇ　Ｅｎｔｒｙ—Ｅｘｉｔ　Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ　Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ　ａｎｄ　Ｂｕｒｅａｕ　ｏｆ　Ｐ．Ｒ．Ｃ，Ｗｅｉｆａｎｇ。Ｓｈａｎｄｏｎｇ，２６１０４１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｓｅｒｕｍ　Ｉｎｄｅｘｅｓ　ｄｙｎａｍｉｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　ａｎｄ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｂｒｅｅｄ—　ｅｒ　ｂｒｏｉｌｅｒ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＲＥＶ　ａｎｄ　ＡＬＶ－Ｊ　ｗａｓ　ｆｉｒｓｔ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｏｎｅ－ｄａｙ－ｏｌｄ　ＨＢＤ　ｂｒｅｅｄｅｒ　ｂｒｏｉｌｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＲＥＶ　ａｎｄ　ＡＬＶ—Ｊ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｂｏｔｈ　ＲＥＶ　ａｎｄ　ＡＬＶ—Ｊ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔｓ　ａｎｄ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌｌｙ，ａｎｄ　ｓｅｒｕｍ　ｇｒｏｓｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＰ），ｈｉｇｈ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｈｏ—　ｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＨＤＬ—ｃ），ｌｏｗ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＬ—ｃ），ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＴＧ）ａｎｄ　ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＣＨＯ）ｗｅｒ　ｄｅｔｅｃ—　ｔｅｄ　ｂｙ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｕｔｏｍａｔｉｃ　ａｎａｌｙｚｅｒ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｄｙｎａｍｉｃ　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ＴＰ，ＴＧ，ＬＤＬ－ｃ　ｃｏｒｒｅ—　ｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｓｅｖｅｎ　ｗｅｅｋｓ．Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ。ｃｏｎｃｅｎｔｒａ－　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＰ，ＴＧ，ＬＤＬ～ｃ　ｉｎｃｒｅａｓｅ．Ａｆｔｅｒ　ｔｈａｔ　ｐｅｒｉｏｄ，ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｄｅｐｅｎｄａｂｉｌｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅｍ．Ｗｈｉｌｅ　ｃｏｎ—　ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＤＬ－ｃ　ａｎｄ　ＣＨＯ　ｄｉｄｆｆｔ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅ　ｗｉｔｈ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｅｃａｕｓｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ｖｉｒｕｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｓｅｅｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｄｙｎａｍｉｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｉｎｄｅｘｅｓ　ｉｎ　ｅａｒｌｙ　ｓｔａｇｅ，ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｓｅｒｕｍ　ｉｎｄｅｘｅｓ　ｄｙｎａｍｉｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　ａｎｄ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｂｒｅｅｄｅｒ　ｂｒｏｉｌｅｒ　ｗｉｔｈｉｎ　７　ｗｅｅｋｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｄｅ－　ｔｅｃｔｅｄ　ａｓ　ａ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｅａｒｌｙ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｒｅｔｉｃｕｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ；Ａｖｉａｎ　ｌｅｕｋｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ｓｕｂｇｒｏｕｐ　Ｊ；ｓｅｒｕｍ　ｉｎｄｅｘ；ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｕｐｐｒｅｓ—　ｓｉｏｎ