叶酸、核黄素缺乏及MTHFR A1298C多态性对人淋巴细胞基因组遗传稳定性的

2024-07-29 作者:

叶酸、核黄素缺乏及MTHFR A1298C多态性对人淋巴细胞

基因组遗传稳定性的影响

吴暇玉;邹天宁;夏晓玲;汪旭

【摘 要】背景与目的:叶酸代谢涉及DNA合成及甲基化等重要生化过程,对维持人类遗传稳定性意义重大.亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolate

reductase,MTHFR)对上述两个生化过程之间的分支走向发挥着关键作用,核黄素作为MTHFR的重要辅助成分,亦可能干涉MTHFR的功能,进而影响到遗传稳定性.本研究拟探讨叶酸、核黄素缺乏以及MTHFR基因1298位点多态性对人类淋巴细胞基因组稳定性的综合影响.材料与方法:采用胞质分裂阻断微核分析法研究叶酸(20、200 nmol/L,即LF、HF)和核黄素(1、500 nmol/L,即LR、HR)不同浓度组合以及MTHFR A1298C多态性对培养9 d的人类淋巴细胞基因组稳定性的影响.结果:各MTHFR基因型淋巴细胞在低叶酸高核黄素组合培养条件下的遗传损伤程度均高于所有其它组合,而高叶酸低核黄素组达最低(P＜0.01),各基因型淋巴细胞在高叶酸条件下的微核化双核细胞(MNed BNC)、核质桥(NPB)和核芽(BUD)频率分别为低叶酸条件的46.5%、22%和42.3%;而高核黄素条件下的相应指标则比低核黄素高约6.3%～12.4%;MTHFR 1298AA型遗传稳定性显著高于突变纯合子MTHFR 1298

CC(P＜0.01);叶酸对MNed BNC、NPB、BUD的变异贡献率分别达到91.61%、73.72%和78.07%(P＜0.01);核黄素及MTHFR A1298C多态性对遗传损伤的变异贡献虽接近或达到显著水平,但均不及叶酸;叶酸、核黄素和MTHFR基因型之间的交互作用对上述遗传损伤标记没有显著影响.结论:叶酸、核黄素和MTHFR

A1298C多态性都在一定程度上对基因组稳定性有影响,但相比之下,叶酸在我们的研究中是影响基因组稳定性的主导因素.

【期刊名称】《癌变·畸变·突变》

【年(卷),期】2007(019)004

【总页数】4页(P259-262)

【关键词】叶酸;核黄素;亚甲基四氢叶酸还原酶;基因多态性;胞质阻断微核分析;基因组稳定性

【作 者】吴暇玉;邹天宁;夏晓玲;汪旭

【作者单位】云南师范大学生命科学学院,云南,昆明,650092;昆明医学院第三附属医院,云南,昆明,650118;昆明医学院第二附属医院,云南,昆明,650101;云南师范大学生命科学学院,云南,昆明,650092

【正文语种】中 文

【中图分类】R994.6

叶酸代谢主要涉及DNA合成和DNA甲基化两个生化过程，在维持基因组稳定性中发挥着重要作用。人体叶酸代谢异常或叶酸缺乏，可能会导致dTMP合成受阻、尿嘧啶掺入DNA、DNA甲基化模式改变，诱发错配、DNA链断裂等一系列遗传毒性事件，从而影响基因组的稳定性，亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene

tetrahydrofolate reductase，MTHFR）及黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine

dinucleotide，FAD）均参与叶酸代谢的关键生化过程[1-2]。

MTHFR是叶酸代谢途径中的关键酶，其在黄素腺嘌呤二核苷酸辅助下催化5，10-亚甲基四氢叶酸向血浆中5-甲基四氢叶酸转化。MTHFR的催化作用对细胞中各种衍生形式的叶酸在DNA甲基化过程或是DNA合成之间的分支走向发挥着关键作用[3-4]。MTHFR基因在人群中存在若干多态形式，其中第1298位A颠换

为C（A1298C）使丙氨酸被谷氨酸替换，从而影响该酶活性，研究发现其杂合体AC和纯合体CC的酶活性与野生型AA相比有显著降低[5-6]。

在叶酸代谢途径中，核黄素作为MTHFR的辅酶——黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的前体，因此它也是叶酸代谢和许多氧化-还原反应不可缺少的维生素，其摄入状况与MTHFR酶活性密切相关[7]。

本研究采用胞质阻断微核分析法（cytokinesis-block micronucleus assay，CBMN），评价若干可能影响基因组稳定性的因素——MTHFR多态性、叶酸和核黄素缺乏对体外培养的人淋巴细胞基因组稳定性的影响，进而为探讨饮食、微营养物质与基因的相互作用模式提供理论基础。

1.1 材料

采集健康女性志愿者（44例，年龄37～59岁）外周血，每例6 ml，供血者近期未额外补充叶酸、核黄素。由本实验室进行基因型分析并从中筛选MTHFR 1298位点AA型、AC型和CC型个体各6例。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA抽提及MTHFR A1298C多态性分析从每个血样中取出300μl全血，用北京鼎国公司提供的试剂盒抽提核DNA，MTHFR A1298C多态性分析参考文献[8]。

1.2.2 培养基设置基于本实验室以往研究，将叶酸（FA）和核黄素（RF）的含量分别设置了缺乏和足量2个水平，形成不同的组合浓度。叶酸设为20和200

nmol/L 2个水平，即LF和HF，前者为低限生理浓度，后者为维持离体淋巴细胞基因组稳定性的充足浓度；根据生理浓度（5～50 nmol/L），核黄素设为1

nmol/L和500 nmol/L（即LR和HR）2个水平，分别是维持淋巴细胞株基因组稳定性的缺乏和足量浓度（待发表）；鉴于叶酸代谢途径中过高的甲硫氨酸可能抑制MTHFR功能，因此将甲硫氨酸设为生理浓度高限50μmol/L；4种组合培养基

依次命名为低叶酸低核黄素、低叶酸高核黄素、高叶酸低核黄素和高叶酸高核黄素组（即LFLR、LFHR、HFLR和HFHR），培养基其他成分及浓度与RPMI-1640培养基一致。

1.2.3 淋巴细胞分离及培养采用淋巴细胞分离液进行淋巴细胞分离，Hank's液清洗后分别均匀接种到LFLR、LFHR、HFLR、HFHR组合培养基中[8%透析小牛血清，100 U双抗，2 mmol/L的L-谷氨酰胺、植物血球凝集素（PHA）和白介素适量、pH 7.0、37℃、5%CO2]，分别于培养的第3 d和第6 d换入新鲜无PHA的培养基继续培养，第8 d按4.5μg/ml的终浓度加入细胞松弛素B，继续培养28 h后，于第9 d收获细胞。用含7%DMSO的培养基处理细胞10 min后，TXD3细胞离心，涂片，涂片后的载玻片在25℃下干燥2 h左右，将片子放入新配制的甲醇:冰醋酸（体积比为3:1）固定液中，固定10 min，空气干燥，将干燥的片子在Giemsa染液（母液与蒸馏水体积比为1:6）中染色6 min，空气干燥，封片。在显微镜100倍镜头下，分析微核化双核细胞（micronucleated binucleated cell，MNed BNC）、核质桥（nucleoplasmic bridge，NPB）和核芽（nuclear bud，BUD）3项遗传损伤指标频率，每例样本的各浓度组分析2 000～3 000个双核细胞，所有技术分析标准参照文献[9]。

1.3 统计学方法

MTHFR A1298C基因型、叶酸、核黄素对基因组稳定性影响的ANOVA分析用SPSS14.0软件进行；三者对遗传损伤的贡献率及其交互作用分别用GraphPad

Prism 4软件中的2-way ANOVA和3-way ANOVA分析。

结果见表1、2和图1。实验发现，任何一种基因型个体淋巴细胞遗传损伤频率均在LFHR组达到最高，而在HFLR组降至最低，尽管HFHR组RF浓度最高但却没有进一步降低遗传损伤（表1）。将相同培养条件下所有基因型个体淋巴细胞的遗传损伤频率综合起来比较，发现在HF（HFLR+HFHR）条件下样本中的MNed

BNC、NPB、BUD频率比LF条件下分别降低了46.5%、22%和42.3%；而在HR（LFHR+HFHR）培养条件下相应的遗传损伤比LR条件下高6.3%～12.4%；叶酸对MNed BNC、NPB、BUD的变异贡献率达到91.61%，73.72%和78.07%，均达到显著水平；核黄素对3个指标均没有显著贡献，MTHFR

A1298C多态性仅对MNed BNC、BUD有显著贡献，分别为16.12%和30%。

比较相同培养条件下的野生纯合子1298AA、杂合子AC和突变纯合子CC的遗传损伤，发现CC型个体的BUD频率显著高于AA型和AC型，就CC型个体的MNed BNC、NPB频率而言，虽然没有显著性差异，但也都高于AA型和AC型，提示1298CC型遗传稳定性不及野生型AA和杂合型AC（图1）。

叶酸是人体正常发育的重要微营养物质（micronutrient），其主要作用表现为：保证DNA的正常甲基化，维持特定基因的正常表达与DNA构型，以及保证某些着丝粒部位高度甲基化的染色体正常分离。叶酸代谢主要涉及DNA合成和DNA甲基化两个生化过程，对于防止染色体损伤和DNA甲基化不足具有重要意义[1-2]。

MTHFR是叶酸代谢途径中的核心酶，该酶的催化作用对各种衍生形式的叶酸在DNA甲基化过程或DNA合成之间的分支走向发挥着关键作用。MTHFR基因在人群中存在若干多态形式，可能会影响到不同形式叶酸之间的代谢平衡进而构成影响叶酸代谢结局的遗传因素[3-4]。在叶酸代谢途径中，核黄素作为MTHFR的辅酶——黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的前体，因此它也是叶酸代谢和许多氧化-还原反应不可缺少的维生素，其摄入状况与MTHFR酶活性密切相关。该维生素的足量摄入，有可能在一定程度上补偿由突变所引发的MTHFR活性下降[7]。

本研究从叶酸、核黄素和MTHFR在叶酸代谢中的作用出发，利用不同组合的培养条件，探讨叶酸、核黄素和MTHFR基因多态性对人类基因组稳定性的影响，对于理解膳食因素对不同遗传背景个体的影响有很好的指导意义。

研究发现，对于任何MTHFR A1298C基因型，在LFHR组合培养条件下的遗传损伤程度均高于所有其它组合，而HFLR组则为最低，各基因型淋巴细胞在高叶酸条件下的遗传损伤频率显著低于低叶酸组；而高核黄素条件下的相应指标则略比低核黄素高。这提示单纯提高核黄素浓度，可能使得MTHFR活性增强，进而使得叶酸代谢偏向于DNA甲基化这一路径，而dTMP合成受阻，导致过多的尿吡啶掺入DNA合成中，从而在DNA复制与修复过程中引起DNA损伤和染色体结构异常，并最终表现为MNed BNC、NPB、BUD等频率的上升。

对比不同MTHFR A1298C基因型发现，MTHFR 1298AA遗传稳定性显著高于突变纯合子MTHFR 1298 CC，由于MTHFR 1298 CC个体的MTHFR活性降低，其基因组稳定性下降的原因可能是由于DNA甲基化程度下降所引起，因为这会引起DNA损伤和染色体分离异常。

我们的研究提示，在本实验条件下，叶酸是维持基因组稳定性的最主要因素，叶酸和核黄素作用机制不同，在考虑上述2种微营养素干涉时，应注重二者的合理配比。

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