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2024年5月16日发(作者：)
广西大学环境工程基础实验
实验题目:湖塘水体叶绿素a测定
1.实验概述
1.1实验目的及要求
⑴初步了解叶绿素a测定的原理和常规测定方法；
⑵通过实验，掌握叶绿素a的测定方法及富营养化水样的前处理方法；
⑶熟练掌握抽滤装置及分光光度计的使用。
1.2实验原理
浮游植物的主要光合色素是叶绿素，常见的有叶绿素a、b和c.叶绿素a存
在于所有的浮游植物中，大约占有机物干重的1~2%是估算浮游植物生物量的重
要指标，因此浮游植物叶绿素a含量的测定成为浮游植物量的重要指标而被广泛
应用。
浮游植物叶绿素a的测定方法有许多种，根据所使用的仪器可以分为高效液
相色谱法（HPLC法）、荧光光度计法和分光光度计法等。高效液相色谱法能够
很精确地测定各种光合色素的含量，但由于仪器昂贵，分析操作步骤繁琐，一般
不能用于野外大量样品的快速分析。荧光光度计也能够精确地测定叶绿素a的含
量，特别是能够测定叶绿素a含量较低的样品，但由于分析过程中容易受其他色
素或色素衍生物的干扰，也不利于快速分析各类不同的野外样品。因此，分光光
度计法成为最常用的浮游植物叶绿素a含量的测定方法。
在所有分光光度计法中，根据所用的色素萃取液分为了丙酮法、甲醇法和乙
醇法等，再根据比色所用的波长，又分为单色法和多色法（例如单色丙酮法和四
色丙酮法）等。主要的细胞破碎法有研磨、低温冻融、超声破碎等。尽管丙酮现
在仍广泛用于实际分析中，但由于丙酮的萃取效率比较差，特别是对蓝藻的叶绿
素a的萃取效率比较低，使得甲醇和乙醇成为替代丙酮的色素萃取剂。不过，甲
醇对人体毒害性大，且在酸化过程中容易产生误差，于是，乙醇成为现在广泛应
用的叶绿素a的萃取剂。超声波破碎法因快速、提取效率高等特点也被研究者所
青睐。
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广西大学环境工程基础实验
2.实验内容
2.1实验方案设计
叶绿素是植物光合作用中的重要光和色素，通过测定浮游植物叶绿素，可初
步掌握水体质量，在水质监测中，可将叶绿素a作为湖泊富营养化的指标之一。
在叶绿素a含量测定试验中，根据需要进行分层采样或混合采样，采样量视
浮游植物的分布量而定，若浮游植物分布较少，则可多采样。根据本组实验所用
湖塘的特点，决定采用混合采样，分四个点采样共2L后将水样混合。水样采集
后进行实验预处理，装成2个500mL平行样，再将实验室原来配好的铜绿微囊
藻稀释液取2个30mL平行样。
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光
度计在某一特定波长下测定其光密度，即可用公式计算出提取液中叶绿素的含量。因此我们
利用分光光度计，首先测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，进行浊度
校正，然后利用公式算出提取液中叶绿素a的含量。
2.2实验过程（实验步骤、记录、数据、分析 ）
2.2.1实验步骤
⑴水样前处理：当天现取水样，装成2个500mL平行样，再将实验室原来
配好的铜绿微囊藻稀释液取2个30mL平行样。将水样通过醋酸纤维滤膜抽滤，
抽滤时负压不应大于0.5大气压（50kPa）。抽滤完毕后，用镊子小心的取下滤膜，
将其对折（有浮游植物样品的一面向里），再用普通滤纸吸压，尽量去除滤膜上
的水分；滤膜放置表面皿上冷冻12h以上。
⑵Chl-a的提取：将滤膜剪碎，放入具塞离心管，加入6mL热乙醇（75℃恒
温提取2min后用细胞破碎仪破碎，超声时间3s，间隔2s，破碎3min后，用少
量上清液清洗细胞破碎仪探头（小于1mL）。将装有提取液的离心管放入离心机，
转速4000r/min下离心10min，将上清液移入10mL比色管中，再用2mL热乙醇
提取液清洗、离心二次取得上清液。最后将提取液定容到10mL。
⑶Chl-a含量的测定：用含90%的乙醇溶液作为空白对分光光度计调零。分
别记录在750nm与665nm处各自的吸光度（分别记为750a和665a），750nm处
的测定是用来进行浊度校正的，吸光度应很低。665nm处的吸光度应在0.1~0.8
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