牛轮状病毒的分离与细胞培养特性

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2024年6月2日发(作者：)

牛轮状病毒的分离与细胞培养特性

魏锁成;冯若飞;巩转娣;田风林

【摘 要】探讨牛轮状病毒(BRV)的细胞培养方法,为研发诊断试剂盒和疫苗提供依

据.将RT-PCR阳性样品在MA-104细胞及Vero细胞上进行培养,盲传4代后

MA-104细胞出现病变(CPE),主要表现为细胞脱落,出现拉网现象,部分出现死亡.这

表明轮状病毒能够在MA-104细胞上生长,并引起细胞病变;而Vero细胞无病变.用

胰酶处理的病毒接种MA-104细胞,用含2 μg/mL、3 μg/mL和5μg/mL三种(A、

B和C)不同浓度胰酶的培养液在MA-104和Vero细胞对犊牛轮状病毒传代培养.

将分离培养的病毒经聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果表明BRV在C组培养液中分离培养

最好,聚丙烯酰胺凝胶电泳图显示病毒核酸呈4:2:3:2排列,与参考株NCDV相似,呈

典型A群轮状病毒的特征.

【期刊名称】《西北民族大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2010(031)004

【总页数】5页(P71-75)

【关键词】轮状病毒;MA-104细胞;细胞病变;培养;胰酶

【作 者】魏锁成;冯若飞;巩转娣;田风林

【作者单位】西北民族大学,生命科学与工程学院,甘肃,兰州,730030;西北民族大学,

生命科学与工程学院,甘肃,兰州,730030;西北民族大学,医学院附属医院,甘肃,兰

州,730030;西北民族大学,生命科学与工程学院,甘肃,兰州,730030

【正文语种】中 文

【中图分类】Q93-337

自从1968年由Mebus等在美国阿拉斯加州一农场犊牛腹泻病例中分离到牛轮状

病毒后,随后许多国家都有牛轮状病毒感染的报道,我国亦有牛感染轮状病毒的报道.

轮状病毒主要感染1～7日龄的犊牛,可引起犊牛消化道机能紊乱,临床上以呕吐、

腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱为特征.感染牛常发生死亡,病死率可达50%.据报道英

国犊牛轮状病毒腹泻的发病率为60%～80%,死亡率为0%～50%[1,2].由于目前尚

无治疗牛轮状病毒感染的特效药物,治疗效果不佳,因此仍以疫苗预防为主.而细胞分

离培养的成功与否是疫苗研制的关键之一.

轮状病毒分离培养比较困难,应用易感细胞和胰蛋白酶处理是细胞培养分离轮状病

毒的关键[3～5].轮状病毒的分离培养在最初多采用原代细胞,后来易感细胞系恒河

猴肾传代细胞MA-104的引进,已先后成功地分离到适应于细胞培养的多种动物轮

状病毒细胞株.1982年我国首次应用MA-104细胞系分离到牛轮状病毒,开始了牛

轮状病毒的研究.目前,利用基因工程技术,将编码VP4和VP7蛋白的VP4和VP7

基因克隆表达出来作抗原,已成为国内外轮状病毒基因工程疫苗研究的主要方向

[6,7].本文以MA-104和Vero细胞对犊牛腹泻粪便中轮状病毒进行培养分离.并用

不同浓度的维持液将轮状病毒在易感细胞MA-104上进行对比培养.以期探讨MA-

104和Vero对RV细胞培养的效果,找到RV细胞培养的新途径.

1 实验材料

1.1 病料采集

上述用轮状病毒检测呈阳性的粪样.

1.2 毒株

NCDV参考毒株(AV 52,G6血清型),购于中国兽医药品监察所.

1.3 MA-104细胞

购自兰州百源基因生物技术公司,由兰州民海生物工程公司传代保存.

1.4 主要试剂

DM EM(Gibco)、胎牛血清(Hyclone)、胰蛋白酶 (Gibco)、PBS(自制),谷氨酰胺

(Glutamine,Merk公司),0.01 mol/L PBS(p H 7.2),D-Hank’s液 ,胰酶 .

1.5 细胞培养液的配制

1.5.1 细胞生长液 10%胎牛血清,DM EM,青霉素100 U/mL,链霉素100μg/mL.

1.5.2 接毒前病毒处理液 50μg/mL胰酶,DM EM,青霉素100 U/mL,链霉素

100μg/mL.

1.5.3 接种病毒后的细胞维持液 A液:2μg/mL胰酶,DM EM,青霉素100 U/m L,链

霉素100μg/mL.B液:3μg/mL胰酶,DM EM,青霉素100 U/mL,链霉素

100μg/mL.C液:5μg/mL胰酶DM EM,青霉素100 U/mL,链霉素100μg/mL.

1.6 主要仪器

H1650-W小型离心机(湖南湘仪),DL-CJ-1N超净工作台(苏净安泰),台式 PCR仪

(Biometra),DYY-12型电泳仪及电泳槽(北京六一),高速低温离心机(美国

Sigma),CK41型荧光倒置相差显微镜(Olympus);3110型 CO2培养箱(Thermo).

2 实验方法

2.1 粪便样本的处理

制备10%的样本悬液,EL ISA检测的阳性粪便样本200μL粪便加入EP管中,加入

标本处理液,振荡3次,每次20 s,静置10 min,8 000 r/min,离心5 min,吸取上清,

用0.22 nm的膜过滤除菌后分装,-20℃保存.

2.2 细胞复苏及培养

取冻存的MA-104和Vero细胞,37℃水浴,晃动至完全融化,用移液器吸取细胞液,

移至含10 mL细胞培养液的培养瓶中,5%CO2,37℃培养,待细胞贴壁后更换营养液,

继续培养,如此重复,直至细胞长到90%以上进行传代.传代时取长满单层的细胞,用

少量PBS溶液轻洗细胞表面,加入适量胰酶消化液(2 mL/75 cm2)37℃消化,光镜下

观察绝大部分细胞肿胀、变圆,翻转细胞瓶,吸去消化液,轻拍细胞瓶,使细胞自壁脱落,

加入适量含10%胎牛血清的DM EM细胞培养液,用吸管上下吹打数次以打散细胞

团块,混合均匀后,按1∶2比例移至新的细胞瓶中,5%CO2,37℃继续培养.

2.3 病毒激活处理

吸取上述粪样悬液和NCDV株各1 mL,加入含50 ug/mL胰酶的DM EM营养液

中激活1.5 h,其间摇匀3～5次,以备接毒.

2.4 病毒的培养

将胰酶处理过的RV接种于生长良好的Vero细胞和MA-104细胞中,37℃吸附1

h,其间摇匀2～3次,取上清,补加细胞维持液后进行培养观察.另再设三组生长良好

的MA-104细胞的瓶子分别补加8～12 m L含胰蛋白酶2 ug/m L的细胞维持液,

含胰蛋白酶3 ug/m L的细胞维持液、含胰蛋白酶2 ug/mL的细胞维持液,并设阴

性对照,37℃5%CO2培养箱培养4～6 d,见明显细胞病变效应CPE时,收细胞培养

液,冻融2次,作下一代培养物的接种物.如果不出现CPE的继续盲传,直至出现CPE,

收毒后于-80℃冻存.

3 结果

3.1 细胞病变结果

细胞病变结果见图1～图6.图1为接毒前的MA-104细胞,图2～图4分别为用A、

B和C组胰酶培养液下经盲传4代后的发生病变MA-104细胞.可以看出,经5

ug/mL胰酶培养液经盲传4代后,MA-104细胞发生的病变最明显.图5为接毒前

没有病变的Vero细胞,图6为接毒盲传4代后的Vero细胞,相比有些病变,还不是

很明显.说明用5 ug/mL胰酶培养液分离培养牛轮状病毒效果更佳.

3.2 分离培养病毒株的病变情况分析结果

用MA-104和Vero细胞对犊牛腹泻粪便中轮状病毒进行培养分离.盲传四代后细

胞出现病变,Vero细胞病变不太明显.故将MA-104细胞的维持液更换,进行不同浓

度含胰酶培养液实验,统计显示含5 ug/m L胰酶的细胞维持液细胞发生病变率为

100%(表1).

表1 轮状病毒在不同浓度培养液下的病变情况培养液 接种孔数 CPE+ CPE-

CPE(%)MA-104(A液) 10 5 5 50 MA-104(B液) 10 7 3 70 MA-104(C液)

10 10 0 100 Vero细胞 10 1 9 10对照组 10 0 0 0

3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示病毒核酸呈4∶2∶3∶2排列,与参考株NCDV类似.

为典型A群轮状病毒的特征(图7).证明分离到一株牛轮状病毒,暂时命名为 GSB01

株.

图7 病毒核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳

4 分析与讨论

轮状病毒分离培养比较困难,除A群轮状病毒外,其他轮状病毒的许多毒株迄今未能

适应细胞培养,分离成功率只为40%～70%[8].病毒粒子中含有RNA依赖RNA聚

合酶以及其他与RNA转录加有关的酶类,病毒在感染细胞浆内复制,病毒在混合感

染时基因组能够发生基因重排,病毒在体外培养需要经过胰酶处理,胰蛋白酶通过裂

解体外衣壳蛋白VP4而增强病毒感染性,所以轮状病毒的分离培养用胰酶的激活是

关键[9,10].病毒粒子通过内质网出芽形成,在出芽过程中形成一个临时囊膜结构,成

熟病毒粒子通过感染细胞膜溶解释放出来.轮状病毒的分离培养在最初多采用原代

细胞,后来易感细胞系恒河猴肾传代细胞MA-104的引进,已先后成功地分离到适应

于细胞培养的多种动物轮状病毒细胞株.常用的还有人干细胞系HePG3、人克隆细

胞CaCo-2、原代非洲绿猴肾细胞系AGM K和非洲绿猴肾细胞系CV 1[11].1982

年我国倪亚炜等首次应用MA-104细胞系分离到牛轮状病毒,开始了牛轮状病毒的

研究.笔者用不含犊牛血清含50 ug/mL胰酶DM EM营养液将病毒激活1.5 h后

用不含血清但含有5 ug/m L胰酶的DM EM维持液进行轮状病毒培养在MA-104

和Vero细胞上.结果发现轮状病毒在MA-104细胞上经过盲传4代后出现明显的

病变,而在Vero细胞上盲传了5带后才出现微弱的病变.因此,轮状病毒分离培养的

易感细胞是MA-104.

为了在细胞培养中复制轮状病毒和连续传代,初代分离病毒或病毒在细胞中连续传

代时,在营养液中加入胰蛋白酶常可提高病毒数倍至上百倍.胰蛋白酶促进轮状病毒

感染性的主要原因在于胰蛋白酶对轮状病毒表面蛋白VP4的作用[12].VP4是一种

病毒粘附蛋白,与轮状病毒毒性有关,能抑制病毒吸附到宿主细胞上.但VP4对蛋白

水解酶敏感,经胰蛋白酶处理后,VP4可裂解为VP5和VP8两个多肽,使其暴露出与

细胞受体相结合的位点,提高了病毒的感染力和病毒侵入细胞的能力,从而使其失去

了对细胞生长的抑制作用,增强了病毒的生长繁殖能力[13].本实验通过将轮状病毒

阳性粪样接种于两种不用的细胞,用三种不同的维持液来培养观察,得出一培养分离

犊牛轮状病毒的最佳方法[14,15],为深入了解动物轮状病毒的特征及研发轮状病毒

检测试剂盒和疫苗提供了实验依据[16,17].

参考文献:

[1]陈溥言.兽医传染病学(第五版)[M].北京:中国农业出版社,2006.

[2]魏锁成.动物轮状病毒病的流行病学及综合防治[J].甘肃畜牧兽医,2005,35(3):27-

29.

[3]王鹏雁,陈创夫.猪轮状病毒的细胞培养[J].石河子大学学报(自然科学

版),2002,6(4):281-284.

[4]Fukusho A,Shixnizu Y,Ito ion of Cytopathic Rotavirus in cell roller

culture in the presenceof Trypsin[J].Arch Virol,1981,69:49-60.

[5]鱼轲,魏至栋,庞兴,等.不同代次牛肾原代细胞培养轮状病毒的比较研究[J].微生物

学免疫学进展,2007,35(4):1-5.

[6]杨国峰,周鹏,王健伟.轮状病毒疫苗研究进展及其转基因植物疫苗的开发前景[J].

生物技术通报,2001,1:16-19.

[7]邱昌庆,才学鹏.动物疫病基因工程疫苗研究与进展[M].北京:中国农业出版

社,2005.

[8]殷震,刘景华.动物病毒学(第2版)[M].北京:科学出版社,1997.456-466.

[9]金奇编.医学分子病毒学[M].北京:中国科学出版社,2001.

[10]Skern.T.病毒学精要概览(Coffee House Noteson Virology,双语版)[M].北京:

科学出版社,2010.

[11]栾婧婧,杨少华,张维军,等.半巢式RT-PCR快速检测犊牛轮状病毒方法的建立[J].

中国人畜共患病学报,2006,(22)7:671-674.

[12]Parwani A V,Hussein H A,Rosen B I,et terization of field

strainsof group A bovine rotaviruses by using polymerase chain reaction-

generated G and P type-specific cDNA probes[J]..M

icrobiol,1993,31:2010-2015.

[13]田风林,魏锁成.动物轮状病毒性胃肠炎的研究进展[J].西北民族大学学

报,2008,29(2):43-48.

[14]Sato K,In山 a ion of Human Rot}mirus in、ell cultures[J].Arch

Virol,1987,69:155-160.

[15]苏小庚,吴周良,王正秀,等.犊牛轮状病毒的分离鉴定[J].河北农业大学学

报,2005,28(4):93-100.

[16]鱼轲,魏至栋,庞兴,等.不同代次牛肾原代细胞培养轮状病毒的比较研究[J].微生

物学免疫学进展,2007,35(4):1-5.

[17]杨国峰,周鹏,王健伟.轮状病毒疫苗研究进展及其转基因植物疫苗的开发前景[J].

生物技术通报,2001,1:16-19.

本文标签： 轮状病毒细胞病毒培养分离