五种重要犬病毒微流控芯片检测方法的建立及应用

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2023年12月22日发(作者：)

五种重要犬病毒微流控芯片检测方法的建立及应用熊　炜，林颖峥，薛俊欣，蒋　静，王巧全，张　强，李　健（上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海　200135）摘　要：狂犬病毒、伪狂犬病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒是引起犬科动物重要传染病的5种病毒，严重威胁着犬科动物的健康，是出入境犬科动物重点筛查的致病因子。为提升口岸进出境犬科动物检疫工作效率，建立了上述5种病毒微流控芯片检测方法。在建立5种病毒环等温扩增检测技术（loop mediated isothermal

amplification，LAMP）的基础上，将这些LAMP检测体系固化在同一块塑料芯片上，制备了同步高通量快速检测微流控芯片，并将其应用于临床检测。结果显示：微流控芯片检测方法具有良好的特异性，含有目的基因的阳性样本仅在芯片上相应病毒反应槽出现显著扩增，而其他病毒反应槽未出现扩增，彼此无交叉反应；微流控芯片的敏感性与LAMP方法一致；通过检测不同时期收集的感染犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒临床样本，证实建立的微流控芯片检测方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有核酸检测方法相比，微流控芯片可以在受试核酸上样40 min内完成上述5种犬病毒的快速筛查，从而满足进出境犬科动物快速检疫的需求。关键词：微流控芯片；狂犬病毒；伪狂犬病毒；犬瘟热病毒；犬细小病毒；犬冠状病毒中图分类号：S852.65　　文献标识码：A　　文章编号：1005-944X（2021）05-0104-05DOI：10.3969/.1005-944X.2021.05.020　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Establishment and Application of the Microfluidic Chip Assay for

Five Kinds of Major Canine VirusesXiong Wei，Lin Yingzheng，Xue Junxin，Jiang Jing，Wang Qiaoquan，Zhang Qiang，Li Jian（Technical Center for Animal，Plant and Food Inspection and Quarantine，Shanghai Customs，Shanghai　200135，China）Rabies virus，pseudorabies virus，canine distemper virus，canine parvovirus and canine coronavirus are

Abstract：five kinds of viruses that cause important infectious diseases of canine，which seriously threaten the health of canine，and are the key pathogenic factors to be screened and examined by the exit-entry ports. In order to improve the efficiency

of port entry-exit quarantine for canine，a microfluidic chip assay for the above five viruses was established. Five loop-mediated isothermal amplification（LAMP）assays were specifically established and then solidified on the same plastic

chip to prepare a microfluidic chip with high-throughput and rapid detection capacity for clinical detection. The results

showed that the established assay had a good specificity where positive samples with targeted genes were obviously

amplified only in the reaction tank in corresponding viruses instead of other viruses，and no cross reaction with each

other was found；the sensitivity of microfluidic chip was consistent with that of LAMP；the established assay was

with good stability and reliability as verified through detecting clinical samples infected with canine distemper virus

and canine parvovirus and collected in different periods. Compared to existing nucleic acid detection methods，the

microfluidic chip could be used to complete rapid screening of the above five viruses within

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收稿日期：2020-08-04　修回日期：2021-03-14基金项目：国家重点研发计划专项（2017YFF0210202）xuejunxin@通信作者：薛俊欣。E-mail：104

2021年第38卷第5期of nucleic acids，which could satisfy the needs of rapid quarantine for entry-exit canine fluidic chip；rabies virus；pseudorabies virus；canine distemper virus；canine parvovirus；canine

Key words：coronavirus狂犬病毒（rabies virus，RV）、伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）、犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）、犬细小病毒（canine parvovirus，CPV）和犬冠状病毒（canine

coronavirus，CCV）是5种重要的犬科动物传染病病原，严重影响犬科动物的健康[1~6]。微流控芯片技术（microfluidic chip assay）是一种基于环等温扩增技术（loop mediated isothermal amplification，LAMP）的高通量快速核酸检测技术。它将不同病原特异性引物固化在同一块塑料芯片不同的微孔反应槽内；这些微孔反应槽与加样孔相连，通过离心把待检核酸样本均匀地甩入各微孔反应槽内；每块塑料芯片有8个加样孔，每个加样孔与4个微孔反应槽相连，故理论上在1块芯片的8个加样孔加入同一份待检核酸，可以实现32种不同病原的同步检测[7]。与传统PCR或者荧光PCR的单病原检测相比，微流控检测技术使高通量同时筛查多重犬科动物疫病成为可能，但微流控检测的技术原理为LAMP，其检测的敏感性与LAMP检测方法一致，介于PCR和荧光PCR。本研究在建立针对RV、PRV、CDV、CPV和CCV LAMP检测方法的基础上，将这些单病原LAMP检测体系固化于芯片微孔反应槽内，制备了5种犬科动物病毒微流控检测芯片，并用不同的病毒样本及临床样本进行测试，确认了建立的微流控芯片检测方法的有效性和稳定性。1　材料与方法1.1　主要试剂和材料TRIzol，购自Invitrogen公司；Taq酶、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、随机引物，购自Takara公司；Bst DNA聚合酶，购自美国NEB公司；DNA抽提试剂盒（QIAamp DNA Blood

Mini Kits），购自QIAGEN公司；微流控芯片及微流控检测仪，购自上海速芯生物科技有限公司。其他试剂，均购自国药集团上海化学试剂有限公司。1.2　病毒样品来源及处理RV、PRV、CDV、CPV和CCV等毒株和相关临床样本，由本单位保存备用；仙台病毒（Sendai

virus，SV）和鼠肝炎病毒（murine hepatitis virus，MHV），由上海实验动物中心提供；淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis

virus，LCMV）阳性质粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。将待检组织或粪便等临床样品加等体积PBS研磨匀浆，3 000 r/min离心15 min，收集上清液待检。1.3　核酸抽提及cDNA模板制备对于RV、CDV、CCV待检样品，取100

μL上清液或血清，加入1 mL TRIzol试剂提取RNA，并将提取的RNA溶解于30

μL DEPC水中；取11

μL RNA溶液，加入5倍逆转录酶浓缩缓冲液4

μL、dNTP 1

μL、随机引物1

μL、RNA酶抑制剂1

μL、AMV逆转录酶2

μL，置于PCR仪42 ℃反应30 min，即得cDNA模板。对于PRV、CPV待检样品，取200

μL上清液或体液样本，按照DNA抽提试剂盒说明书提取病毒DNA，最后将提取的DNA用100

μL DEPC水溶解。1.4　LAMP引物设计与合成使用Vector NTI Suite软件分析不同国家和地区分离的RV（Genbank登录号：CQ918139）、PRV（Genbank登录号：KT329439）、CDV（Genbank登录号：KF914669）、CPV（Genbank登录号：MF805795）、CCV（Genbank登录号：KT852997）基因保守序列。将序列在线导入Primer Explorer V5软件（/e/），设计上述5种病毒的LAMP引物（表1）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。105

表1　5种犬病毒LAMP引物序列病毒引物序列（5'—3'）F3TGGGGGAGGAAAGTAGTGGB3ATGGAACAGCTGGGTCGARVFIPTCCTGTTGCCCCGCAAGTAC-TTCTGAGATGTTGGGACTGCBIPCTGTGCTCCCGTCCTTTGATC-AGGAGGTGGATGATCCCAAGTF3ACGAGCCCCGCTTCCAB3AGATGCAGGGCTCGTACAPRVFIPAGACCACGCGCGGCATC-AGGCGCTCGGCTTCCACTBIPGAGAACTTTACCGCCACGCTG-GCGTAGTACAGCAGGCACCGF3TGGGTGTGGGTGTTGAACTB3CTCCGTTGTCTTGGATGCTCDVFIPTGCCCGAGCCTGAAATAAGCT-GTGAAAACTCCATGGGAGGGTBIPTGGTCAGAAGATCTGCCGGC-ACCTCTTCCTTGGTGATGCCF3GTAAACCATGTAGACTAACACAB3GCACTATAACCAACCTCAGCCPVFIPCCTTCAGCTTGAGGCAAAGAATT-TATACATGGCAAACAAATAGAGCBIPAGGAGTTCAACAAGATAAAAGAC-GTGGTCTCATAATAGTAGCTTCAGTF3AGGTAACAAGGATCAACAGATB3CCACGATTACCAAGTGTAGTCCVFIPCAGGAAGCTCTTTACGCTGAC-GGTTATTGGAATAGACAAAGCCBIPTGGTCCTCATGCTGATGCAA-GTTTATTCATGGCACCATCC1.5　微流控芯片制作及检测微流控芯片外形如CD盘，直径约80 mm，由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成。芯片由4个独立单元构成，每个单元有2个加样孔和8个反应槽，每个加样孔与4个反应槽相连，但加样孔之间以及反应槽之间不连通。将Bst大片段DNA聚合酶（1

μL）、聚合酶缓冲液（10

μL）、dNTP（2

μL）、荧光染料和不同引物组混合液（2

μL），混合后加至不同的反应槽，用透明封膜将加样槽上样孔封闭。在同1个独立单元的两个加样孔中分别加入5

μL待检样本的核酸，用透明膜密封加样孔。将加样孔固定于微流控检测仪转盘106柱上，盖好机器盖。机器运行条件：63.5 ℃孵育45 min。反应结束后，查看荧光扩增曲线，进行结果判定。1.6　微流控芯片检测CPV敏感性试验为测试微流控芯片检测方法的敏感性，将提取的CPV感染犬的总DNA样本进行定量并梯度稀释，制备浓度分别为100、101、102、103、104和105 copies/mL的DNA模板，再使用微流控芯片方法检测。1.7　临床样本检测为进一步验证建立的微流控芯片检测方法的可靠性，将不同时期收集的6份CDV感染样品（犬肺、肝、脾、肾、血液临床样本以及口鼻液拭子）、10份CPV感染样品（犬粪便、肝、脾、肺、肾和血液临床样品）以及6份CCV感染样品（犬粪便、肝、脾、肺、肾和血液临床样本），共计22份阳性样本和24份健康犬粪拭子，使用微流控芯片进行检测。2　结果与分析2.1　微流控芯片检测5种病毒特异性试验设置MHV、SV和LCMV反应槽为阴性对照，使用5种犬病毒的核酸样本测试微流控芯片检测特异性。结果（图1~5）显示，经微流控芯片检测，在反应10~25 min后，RV、PRV、CDV、CPV和CCV核酸样本均出现了相应荧光扩增曲线，各病毒与其他病毒之间未出现交叉反应，同时所有阴性对照病毒（MHV、SV、LCMV）的反应槽均未出现荧光扩增信号。图1　微流控芯片检测RV特异性试验结果

2021年第38卷第5期图2　微流控芯片检测PRV特异性试验结果图3

微流控芯片检测CDV特异性试验结果图4　微流控芯片检测CPV特异性试验结果图5　微流控芯片检测犬CCV特异性试验结果图6　微流控芯片检测犬CPV敏感性试验结果2.2　CPV敏感性试验使用微流控芯片方法检测不同浓度梯度的CPV DNA模板。结果（图6）显示，微流控芯片检测CPV DNA模板下限量为102 copies/mL。2.3　临床样本检测使用微流控芯片对22份临床阳性样本和24份健康犬粪拭子进行检测。结果显示，经微流控芯片检测，所有CDV、CPV、CCV感染犬的临床样本在反应10~30 min后，均出现相应病毒荧光扩增信号，其中组织样本的扩增信号较强，而24份健康犬粪拭子样本经检测未出现荧光扩增信号。该结果与PCR检测结果一致。3　讨论微流控芯片检测技术是近年来兴起的高通量核酸检测技术。它基于LAMP检测技术，将不同病原LAMP检测体系点制于圆盘形塑料基片上，通过离心将加样孔内的待检核酸样本分散到圆盘基片不同LAMP检测体系反应槽中，然后通过微流控设备的光敏部件检测反应槽中荧光染料信号变化，以判定是否有目的基因特异性扩增[8-9]。理论上，该技术可以实现30多种病原的同步检测。由于微流控芯片检测原理仍然是LAMP技术，其检测的特异性、敏感性和可靠性与LAMP技术相近。本研究尝试将RV、PRV、CDV、CPV和CCV等5种犬病毒LAMP反应体系点制于微流控芯片上，研究将微流控技术应用于多种犬病毒快速检测的可行性。通过特异性试验，证实微流控芯片检测具有107

良好的特异性，其仅能检出待检核酸中特定病毒，其他无关病毒均未出现交叉反应。通过敏感性试验，证实微流控芯片检测CPV的下限为102 copies/mL，其与LAMP和普通PCR方法的检测下限相近。通过对CDV、CPV和CCV感染犬采集的46份临床样本检测，证实微流控芯片检测方法具有较好的稳定性和可靠性，受试样本未出现阳性漏检和阴性误检出。由于LAMP引物设计由网络软件自动生成，有些保守区域软件无法找到合适引物，而搜索出的引物其覆盖序列不一定保守。特别是，针对变异度较大的RNA病毒，LAMP检测引物的兼容性存在一定问题，只能通过多设计几对不同引物进行覆盖。此外，LAMP引物偏长，对于一些易变病毒，设计出理想的、保守度高的引物十分困难。当然，作为一种技术和设计理念的创新，微流控技术有其可取的一面，它使得同步高通量筛查多种病原成为可能[10]。本研究建立了5种重要犬病毒的微流控芯片检测方法，与传统PCR方法相比，微流控芯片检测周期较短，仅需40 min就可完成多种病毒的同时检测，操作简单、检测设备便携（笔记本类似大小，1次充电可运行12 h）、结果判定简便直观，特别适于现场及野外检测。本研究建立的微流控芯片检测新方法，不仅可应用于出入境口岸宠物及野生动物检疫，同时也适合野外监测点、犬猫科动物繁育场和一线兽医检测实验室使用，这对控制犬科动物重大传染病传播，减少特种动物养殖业经济损失，保护公众健康都具有十分重要的意义。参考文献：[1]

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本文标签： 检测芯片微流病毒样本