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2024年5月22日发(作者:)
2021
Vol.40
No.6
•192
Serial
No.352
China
Brewing
Experience
Exchanges
耐高渗酵母选育及其在葡萄酒中的应用研究
金红
,
张小燕,路宏科
,
殷欣
,
张辉
,
彭涛
*
(甘肃省轻工研究院有限责任公司
,
甘肃兰州
730000
)
摘要:
高醇
、
高糖
、
高硫等条件会影响酵母菌的生物活性
。
为筛选出耐高酒精度
、
高糖度
、
高
SO
#
浓度的葡萄酒酿造优良菌株,该实验
采集葡萄酒
、
酒
、
酒
,
经
离纯化得到
8
酵母菌
,
经高酒精度
、
高糖度
、
高
SO
#
耐受 初步
2
株菌株
,
一株耐高糖
,在含糖量
60%
条件下
21.5
h
仍可启动发酵;一株耐高酒精度
,在酒精度
20%vol
条件下
21.3
h
仍可启动发酵;
2
株菌株均可
在
300
mg/L
SO
2
条件下在
6.7
h
启动发酵
。
经生理生化试验初步鉴定两株菌分别为酿酒酵母(
Saccharomyces
cerevisiae)
和膜
S
毕赤氏
酵母
(Pichia
membranefacien^
。
浓缩葡萄汁初始糖含量
28%
条件下接种酿酒酵母,高泡期补料至含糖量
34%
接种膜
S
毕赤氏酵母,
20
!
发酵
15
d
,
得到的葡萄酒酒精度
1&
l%vol
°
关键词:
耐高渗酵母
葡萄酒
文章编号
*
0254-5071
(2021)06-0192-04
doi::.0254-5071.2021.06.037
中图分类号:
TS262.1
引文格式:
金红
,
张小燕,路宏科
,
等
•
耐高渗酵母选育及其在葡萄酒中的应用研究
[J].
中国酿造
,
2021
,
40(6)
:
192-195.
Breeding
of
hyperosmotic
yeasts
and
their
application
in
wine
JIN
Hong,
ZHANG
Xiaoyan,
LU
Hongke,
YIN
Xin,
ZHANG
Hui,
PENG
Tao*
(Gansu
Light
Industry
Research
Institute
Co.,
Ltd.,
Lanzhou
730000,
China)
Abstract
:
High alcohol,
high
sugar,
high
sulfur
and
other
conditions
could
affect
the
biological
activity
of
yeast.
In
order
to
screen
the
excellent
strains
of
wine
brewing
that
tolerate
high
alcohol
content,
high
sugar
content
and
high
SO
2
concentration, 8
strains
were
screened initially
from
wine
lees,
Huangjiu
(Chinese
rice
wine)
lees
and
fermented
grains
after
enrichment
and
screening.
After
high
alcohol
content,
high
sugar
content,
and
high
SO
2
tolerance
experi
ments,
2
strains
were
screened,
one
strain
was
tolerant
to
high
sugar,
and
the
fermentation
could
be
started
at
21.5
h
with
sugar
content
60%,
the
other
one
was
tolerant
to
high
alcohol,
and
the
fermentation
could
be
started
at
21.3
h
after
adding
20%vol
alcohol.
Under
the
condition
of
300
mg/L
SO
2
,
both
strains
could
start
fermentation
at
6.7
h.
The
two
strains
were
preliminarily
identified
as
Saccharomyces
cerevisiae
and
Pichia
membranefaciens
by
physiological
and
biochemical
tests.
S.
cerevisiae
was
inoculated
under
the
condition
of
initial
sugar
content
28%
of
concentrated
grape
juice,
and
then
P.
membranifaciens
was
inoculated
to
sugar
content
34%
at
high
bubble
stage.
The
wine
was
fermented
at
20
!
for
15
d,
and
the
alcohol
content
of
the
wine
was
18.1%vol.
Key
words
:
hyperosmotic
yeast;
breeding;
wine
优良的葡萄酿酒酵母应具备起酵快
,
耐高酒精度
、
高
SO
2
、
高糖
、
高温
、
低温等特性,
同时还应能促使发酵进行彻
底,实现酒体协调
、
易于长期储存等
。
育优良菌
材料与方法
1.1
材料与试剂
,
开辟葡萄酒研发新思路
。
葡萄酒酿造过程中
,
随着发酵底物中酒精
、
糖
、
硫的
浓度变化,酵母菌的耐受力会影响其生长及发酵活性
。
酒
1.1.1
材料
葡萄酒
、
酒
、
酒
葡萄酒
、
酒
、
酒
精浓度不断增加
,
酵母的繁殖速度及存活率会急速下降叫
残糖
、
酸将会影响酒的品质
。
已有研究者对加酒精的培
生
酵母
BV818
酵母
有
。
1.1.2
主要试剂
葡萄糖
、
、
、
酵母
、
酵母
、
糖
、
糖
、
糖
、
酸
、
硫酸
、
硫酸
、
酒精
、
化
进行过酒精耐性对
质
及
长
叽
冏
。
研究表明
,
酵母
活度会随着高渗透胁迫而发生显变
化
,
高盐、
高糖
、
高硫等发酵
境
,
会影响酵母菌的生
生化
1.1.3
培养基
化物
易
化
备
S
,
在葡萄浓醪发酵过程中
,
耐高渗酵母可以
应
于酿酒
S
实对
的酒酵母
网进行
实研
1
堀养基
)
:葡萄糖
5%
,
酵母膏
0.05%
,
KH
2
PO
)
0.25%
,FeSO
)
THO
0.01%
,
MgSO
)
THO
0.1%
,
究
,
耐高渗的酿酒酵母
,
应于葡萄酒酿造
,
优
(NH?
2
SO
)
0.2%
,
灭菌后加Na
2
SO
3
至
30
mg/L
。
酵母浸出粉月东葡萄糖
(yeast
extract
peptone
dextrose
,
化发酵
,
高酒精度
、
收稿日期
*
2020-12-30
的葡萄酒酿造选
修回日期
*
2021-03-18
基金项
0
:
甘肃省技术研究与开发专项计划项目
(
1305TCYA011)
作者简介:
金
红
(1968-)
,
女
,高级工程师
,
本科
,
研究方向为食品科技及发酵工程
。
*
通讯作者:
彭涛
(1970-)
,
男
,
教授级高级工程师
,
硕士
,
研究方向为食品与发酵
。
中国酿造
20
21
年第
40
卷第
6
期
-193-
经验交流
YEPD
)
培养基
(
2
*
培养基
):葡萄糖
“
20
g
、
蛋白
4
20
g
、
牛肉
膏
10
g
、
蒸
9
水
1
000
mL
,
60
g/mL
链霉素;添加20
g/L
琼脂
为固体培养基
。
WL
营养培养基
(
3
7
培养基
)
:
酵母浸粉
0.4%
、
胰蛋白
4
0.5%
、
葡萄糖
5%
、
琼^
旨
2%
;
储液
A
:
KH
(
PO
4
5.5
g
,
KCl
4.25
g
,
CaCl
(
1.25
g
,
MgSO
4
1.25
g
,
定容至
400
mL
,
使用时按
40
mLH
1
000
mL
添加叫储液
B
:FeCl
3
0.25
g
,
MnSC
)
4
0.25
g
,
定容至
100
mL
,
使用时按
1
mL/1
000
mL
添加
,
调
pH
值至
6.5
,
灭菌
后加储液
C
。储液
C
:
0.44
g
]
甲酚绿溶于
100
mL
体积分数
50%
的酒精溶液中
,
使用时按
1
mL/1
000
mL
添加
。
发酵培养基冋
(
4*
培养基
)
:蔗糖
20%
,
KH
2
PO
4
0.1%
,
(
NH
4
)
2
SO
4
0.1%
,
MgSO
4-
7H
2
O
0.1%
,
酵母膏
1%
。
酵母氮基础培养基及酵母碳基础培养基
%
10'
(
5*
培养基
)
:
葡萄糖20.0
g
,
KH
2
PO
4
1.0
g
,
MgSO
4-
7H
2
O
0.5
g
,
酵母膏
0.2
g
,
琼脂
20.0
g
,
蒸
9
水
1
000
mL
。
尿素基础培养基
(
6
*
培养基
)
:
蛋白
4
1.0
g
,
NaCl
5.0
g
,
KH
2
PO
4
2.0
g,
酚红
0.012
g
,
琼脂
20.0
g
,
pH
6.8
,
蒸
9
水
1
000
mL
。
蛋白
4
水培养基
(
7*
培养基
)
:蛋白
4
10
g
,
NaCl
5.0
g
,
蒸
9
水
1
000
mL
,pH
7.6
。
上述培养基均
115
!
灭菌
20
min
。
1.2
仪器与设备
SW-CJ-1FD超净工作台:苏净安泰空气技术有限公司
;
AL204
电子天平:德国
METTLER
TOLEDO
公司
;
LDZX-75-
KBS
锈钢压力蒸汽灭菌器:上海安医器械厂;
BK-
3300
:上海
精
器
;
600
水
:
器
;
FDU-1200
:
EYELA
器
;
SHP-250
生
培养
:
上海
器
;
RE-3000
RE-10000
蒸发器:上海
器厂
。
1.3
方法
1.3.1
酵母菌分离纯化
(
1
)
:
分
的
酒
酒
酒糟
,
储于
中
,
24
h
至
,
备用
。
(
2
)
菌
培养及分
:
的酒
酒
渣
、
鲜酒糟样品分别称取
10
g
,
分别加入
90
mL
灭菌的
1
7
培
养基
,
28
!
、
160
r/min
摇床培养
48
h
。
将培养液用生理盐水
进行不同梯度稀释后
,
涂布于
2
7
培养基上分离
,
28
!
培养
48
h
,
转接并经多次划线纯化,获得纯化菌株
,
接种于试管
斜面
,
依次放入冰箱中,4
!
保存备用
。
(
3
)
将纯化菌株活化后
,
划线接种于
WL培养基上
,
28
!
培养
5
〜
7
d
,
观察记录菌落的颜色及形态特征
,
分类鉴定
。
1.3.2
菌株发酵特性
用杜氏管法对分
的酵母菌
发酵力测定
,
挑选发酵速快
、
起发时间早及发酵味好的菌株
。
酒精耐受性测定:用杜氏管发酵法。
将筛选出的酵母
菌分另
U
接入酒精度分别为
12%vol
、
14%vol
、
16%vol
、
18%vol
、
总第
35
2
期
20%vol
的
2
*
液体培养基中,
28
!
静置培养,
每
12
h
观察一次
,
记录气体充满杜氏管的时间
。
糖
耐受性测定:用杜氏管发酵法
。
将筛选出的酵母
菌分别接入葡萄糖含量分别为
20%
、
30%
、
40%
、
50%
、60%
的
2
7
液体培养基中,
28
!
静置培养
,
每
12
h
观察一次
,
记录
体充满杜氏管的时间
。
SO
2
浓
耐受性测定:用杜氏管发酵法
。
将筛选出的酵
母菌分别接入
SO
2
含量为
100
mg/L
、
150
mg/L
、
200
mg/L
、
250
mg/L
、300
mg/L
的
2
7
液体培养基中
,
28
!
静置培养
,
每
12
h
观察一次
,
记录气体充满杜氏管的时间
。
1.3.3
菌株模拟酒精发酵试验
将筛选菌株转接入
4
*
培养基
,
28
!
静置发酵
,至发酵液
重量再下降时为发酵终点
。
以商品酵母
BV818
作对照
。
1.3.4
生理生化试验
碳源
试
:
含杜氏小管的试管灭菌力口入
5
囁
养基
3-4
mL
,
然向其中半数的试管分加葡萄糖
、
麦
芽糖
、
蔗糖
、
果糖
、
乳糖作为碳源
,
调整糖浓
达到
50
mmol/L
,
灭菌
%
11'
。
所试管都
供试菌
,
以没加碳源的试管
作为对照
,
28
!
培养
7
d
,
观察
。
如果试管出现浑浊为阳性
,
否则为阴性
。
氮源同化试:含杜氏小管的试管灭菌力口入
5
*
培
养基
3-4
mL
,
然向其中半数的试管分加硫酸|
、硝
酸钾
、
亚硝酸钠作为氮源
,
调整氮源浓度达到
50
mmol/L
,
灭菌
。
将所试管都
供试菌
,
以
加氮源的试管作
为对照
。
28
!恒温培养
7
d
,
观察
。
以试管中出现浑浊为阳
性
,
否则为为阴性
。
水解尿素试验:试管中加入
2.7
mL
的
6
7
基础培养基
,
灭
菌后
,
再向每支试管中加
0
.3
mL
无菌水
的
20%
灭菌
的尿素溶液,
斜
。
挑
的菌
,
于
好
的斜面上
,
28
!
培养,每天观察结果
,
5
〜
7d
后
,
若斜面呈
现红色
,
则明此菌能分尿素
'
。
试验重复
3
%
12'
。
1.3.5
葡萄酒发酵试验
%
13
w
18
预试的果示
,
高期流加浓
浓
观
糖
,
以
终发酵酒精
所降
,
此调整葡萄酒
发酵试
为:
浓
观糖为28%
,
高高
期补料后底物外观糖至
34%
;
接种量为
10
6
CFU/mL
;
菌株
接种方式两种:
⑴酿酒酵母和膜髒毕赤氏酵母以
70%
:
30%
、
50%
:
50%
、
30%
:
70%
体
时
浓葡萄汁中
;
(
2
)
发
酵
期
酒酵母,高
期
氏酵母
。
20
!
发酵
15
d
。
1.3.6
测定方法
%
19-23
'
发酵力
:
用
CO
?
量法
;
酒精
:
用
法
;
糖-
用
定法
;
酸
-
用
定法
;
味-
用
定
法
。
2
结果与分析
2.1
酵母菌分离纯化
2021
Vol.40
No.6
•194
Serial
No.352
China
Brewing
表
1
酵母菌的形态特征
Experience
Exchanges
Table
1
Morphological
characteristics
of
yeast
菌株编号菌落形态
白色
,
顶部隆起,边缘光滑圆整
白色
,
顶部隆起,边缘光滑圆整
细胞形态
液体培养特征
无性繁殖方式
两端岀芽
两端岀芽
子囊抱子
A
椭圆
椭圆
椭圆
椭圆
椭圆
梭状
有菌璞
,
沿管壁向上生长
有菌璞
,
沿管壁向上生长
有沉淀
,
液体澄清
2
〜
4
2
〜
4
B
C
D
红色凸起
,
光滑
,
边缘整齐
乳白色
,
顶部凸起
,
表面粗糙
,
边缘齿状
多边发芽
单边岀芽
1
〜
4
无
有沉淀
,
液体混浊
,
沿管壁向上生长
E
红色凸起
,
光滑
,
边缘整齐
奶油色平伏
,
光滑
,
边缘整齐
有沉淀
,
液体澄清
有沉淀
,
液体澄清
有沉淀
,
液体混浊
,
沿管壁向上生长
多边发芽
两端岀芽
单边岀芽
1
〜
4
1
〜
4
无
F
G
H
乳白色
,
顶部凸起
,
表面粗糙
,
边缘齿状
奶油色平伏
,
光滑
,
边缘整齐
椭圆
梭状
有沉淀
,
液体澄清
两端岀芽
1
〜
4
由表
1
可知,从鲜葡萄酒糟
、
鲜黄酒糟
、
鲜酒酷共分离
纯化
8
株
A
、
B
对酒
,
其中菌株
B
耐受
20%vo
1
酒精
菌
,
分
A
〜
(
。
21.3
h
,
可
发
表
4
酵母菌株葡萄糖耐受性试验结果
2.2
菌株发酵特性及耐受性结果分析
2.2.1
菌株发酵特性
Table
4
Glucose
toleranee
test
results
of
yeast
strains
管
测定
,
结果见表
2
。
分离得到的
8
株酵母菌进行发酵力
菌株
A
糖耐受
/h
20
葡萄
分
/%
30
40
50
60
+++++
表
2
优选菌株发酵特性试验结果
+++++
+++++
+
+++++
+++++
+++++
+++++
+++++
+++++
Table
2
Experimental
results
of
fermentation
characteristics
of
the
preferred
yeast
strains
菌株
B
+++++
+++++
+++++
C
起发
+++++
+
发速度
/h
发
E
A
B
+++
+++
+++
+
+
++
++
2.0
4.0
浓酒香味
F
G
+++++
++
酒香味
香草味
香草味
清
+++++
C
D
5.0
14.0
7.0
H
E
F
5.5
3.0
香草味
清
由表
4
可知
,
菌株
A
、
B
D
有
性
,
G
H
均可在耐受
60%
21.5
h
后可以启动发酵
。
+
8.0
酸味
表
5
酵母菌株
SO
耐受性试验结果
注:
“
+
”表示发酵产气,
+
多表
发
速
Table
5
Sulfur
dioxide
toleranee
test
results
of
yeast
strains
由表
2
可知
,
菌株
A
、
B
、
C
发酵速
菌株
A
起发时
菌株
SO2
S
°
2
质量浓度
/(Ag
・
L
I-
)
______________
编号
时间
/h
100
+++++
+++++
+++++
+++++
150
+++++
+++++
+++++
200
+++++
+++++
250
300
,
2
h
,发
有
酒
。
2.2.2
优选酵母菌株的酒精
、
葡萄糖及
S0
2
耐受性
表
3
酵母菌株酒精耐受性试验结果
A
"
+++++
+++++
+++++
++
+++++
+++++
+
C
Table
3
Alcohol
toleranee
test
results
of
yeast
++++
++++
E
++++
++++
菌株
A
酒
酒精度
/%vo1
F
/h
12
+++++
+++++
+++
1416
18
+++++
+++++
+++++
+++++
20
+++
G
H
+++
++
+
+++++
B
C
D
由表
5
可知
,菌株
A
、
B
、
D表现出较强的
SO
2
可在耐受
300
mg/L
SO
2
+
性
,
E
21.3
+
6.7
h
可
菌株
A
、
菌株
B
进行
发酵
。
综
性试验结果
,
酵试验
。
酒精发
F
G
H
+++++
++++
+++++
2.3
优良菌株发酵试验结果分析
注:“
+
”表示杜氏小管中产气,
“
+
”
越多表示产气越多
。
下同
。
由表
6
可知
,菌株
A
产酒
母
BV818
酒
10.8%vo
1
,
高于商品酵
酒
,
可
9.2%vo1
)
,
由表
3
可知
,
,
酒
菌生
殖
酒
菌株
菌株
B
酒
9.2%vo1
BV818
,
菌生
殖
菌株
酒
9.2%vo1
,
可
菌株
。
经验交流
表
6
酵母菌株模拟酒精发酵试验结果
中国酿造
2.4
生理生化鉴定
20
21
年第
40
卷第
6
期
总第
35
2
期
-1
95
-
Table
6
Results
of
simulated
alcoholic
fermentation
of
yeast
strains
对菌株
A
、
菌株
B进行生理生化鉴定
,
结果见表
7
。
由
生理生化试验结果可以初步鉴定菌株
A
、
菌株
B
分别为酿酒
酵母
(
Saccbaromyces
cerevisiae
)
和膜
O
毕赤氏酵母
(Pichi)
membranefhciens
)
。
菌株编号
CO
质量损失
/g
总酸
/(g
・
L
=i
)
酒精度
/%vol
残糖量/(g
・
L
=i
)
香气
A
B
15.1
2.02
2.44
2.38
10.8
30.0
+++
++
14.5
14.7
9.2
9.2
52.0
55.0
BV818
+++
表
7
菌株生理生化鉴定结果
Table
7
Physiological
and
biochemical identification
results
of
the
strain
菌株编
化试验
糖糖
果糖
葡萄糖
+
+
糖
应
化试验
(NHJ
2
SO
4
-+
-+
Na
2
NO
3
-
-
KNO
3
A
B
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
注:
“
+
”
表示反应结果呈阳性'“
■
”
表示反应结果呈阴性
7
2.5
葡萄酒发酵试验结果分析
[4]
李新菊•非酿酒酵母的筛选及多样性研究
[D].
石河子:石河子大学
,
2015.
由表
8
可知
,
在浓缩葡萄汁初始糖含量
28%
条件下接
种菌株
A
,
高泡期补料至含糖量
34%
接种菌株
B
,
20
!
发酵
[5]
[6]
,
高
,
和
[J].
,
•
•白酒酒糟中高耐性酵母菌的分离筛
,
2020
,
22
(
3
93-98.
-
15
d
,
得到的葡萄酒酒精度最高
,
为18.1%vol
„
表
8
浓缩葡萄汁补料分期接入酵母菌株发酵结果
Table
8
Fermentation
results
of
concentrated
grape
juice
feeding
by
.
葡萄酒酿酒酵母菌种的
[J].
,
2011
(4)
:
76-78.
[7]
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[8]
DIAZ
M, HERRERO
M,
GARCIA
L
A,
et
al.
Application
of
flow
cytometry
菌株体积比
A
B
70
30
50
50
30
70
100100
"
"
"
"
:
观糖浓度
/%
_________________酒精度
/
to
industrial
microbial
bioprocesses[J].
Biochem
Eng
J
,
2010,
48(3):
385
-
407.
初始
第1
天
补料至第
3
天
第
9
天第
13
天第
15
天
%
vo@
28.1
28.1
28.1
28.1
14.6
14.8
15.0
14.4
34.1
34.1
34.1
34.1
24.0
22.0
21.5
22.3
21.5
22.3
22.0
20.1
17.3
[9]
王会会
,天明
,
王可
,
等
.
烟台干红葡萄酒发酵过程中酵母种类鉴定
25.3
24.4
21.2
23.1
22.4
20.6
17.0
17.2
18.1
[J].
中国酿造
,
2011
,
30(1)
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33-36.
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王泽举
.
疆
•
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22.0
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J
A,
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R
W,
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Characteristics
and
3
结论
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、
黄酒糟
、
酒
,
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Cambridge
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2000:
分离
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[12]
雷静
,
陈雅
,
仲卫娟
,
等•
响应面法优化无核白甜葡萄酒酿造工艺研究
化得到
8
株酵母菌
,
高酒精度
、
高糖度
、
高
SO
2
试验
后初步筛选岀
2
株菌株
,
一株高糖
,
在含糖量
60%
条下
21.5
h
可
动发酵;一株
高酒精度,
在酒精度
20%vo
l
条
[J].
酿酒科技
,
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[14]
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济南
:
葡萄汁
、
葡萄浓缩汁的发展和生产工艺
[J]
•
葡萄栽培与
件下
21.3
h
仍可启动发酵;
2
株菌株均可在
300
mg/L
SO
2
条
下在
6.7
h
动发酵
。
生理生化试验初步鉴定两株菌
分别为酿酒酵母
(Saccharomyces
cerevisiae
)
和膜
O
毕赤氏酵
酿酒,
1996
,
23
(
3
:
38-39.
[15]
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生
,
2005
,
35
(
1
:
42-48.
母
(Pichia
memb^aneTaciens
)
•
在浓缩葡萄汁初始糖含量
28%
条件下种酿酒酵母,高泡期补料至含糖量
34%
种膜
O
[16]
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J
I,
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fUzzy
control
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industrial
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and
Systems
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2002,
128(1):
117.
毕赤氏酵母
,
20
!
发酵
15
d
,
得到的葡萄酒酒精度为
18.1%vol
°
试验为
葡萄酒酿
的
发酵菌株和
,以期为
[17]
李玉忠
,
金红
,
陈兴叶
,
等
•
采用
术酿
葡萄酒
[
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酿酒
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2015
(
3
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95-98.
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