不同等位HXT3基因对酿酒酵母EC1118发酵特性的影响

2024-07-29 作者:

３０　微生物学杂志　２０１５年２月第３５卷第１期ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ　Ｆｅｂ．２０１５　Ｖｏ１．３５　Ｎｏ．１　不同等位ＨＸＴ３基因对酿酒酵母ＥＣｌｌｌ８发酵特性的影响　赵文英，贾万利，高　莉，王蕊欣　（中北大学化工与环境学院，山西太原０３００５１）　摘要葡萄酒酿酒酵母果糖利用能力与酒精发酵中止和发酵不彻底密切相关，其果糖利用分子机制的研究　备受关注。以高果糖利用葡萄酒酿酒酵母茵ＥＣ１１１８为试验材料，利用重组技术获得了ＨＸＴ３基因敲除茵，通　过酶切和基因测序鉴定，首次发现ＥＣ１１１８具有２个不同的ＨＸＴ３等位基因，并研究了不同ＨＸＴ３等位基因缺　失对茵体发酵过程中葡萄糖、果糖利用的影响。结果表明，突变的ＨＸＴ３一ｃｈａｍｐ基因对保证茵体发酵后期高果　糖利用能力起到了重要的作用，对筛选和构建高果糖利用优良葡萄酒酿酒酵母研究具有重要指导意义。　关键词葡萄酒；酿酒酵母；ＥＣ１１１８；果糖；ＨＸＴ３　Ｑ７８　文献标识码Ａ　文章编号１００５—７０２１（２０１５）０１—００３０一Ｏ５　中图分类号ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５—７０２１．２０１５．０１．００６　Ｅｆｌｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＨＸＴ３　Ａｌｌｅｌｅｓ　ｏｎ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｔｒａｉｔｓ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＥＣ１　１　１８　ＺＨＡＯ　Ｗｅｎ—ｙｉｎｇ，ＪＩＡ　Ｗａｎ—ｌｉ，ＧＡＯ　Ｌｉ，ＷＡＮＧ　Ｒｕｉ—ｘｉｎ　（Ｃｏｌ１．ｏｆＣｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ．＆Ｅｎｖｉｒｏｎｔ，ＮｏＡｈ　Ｕｎｉ．ｏｆＣｈｉｎａ，Ｔａｉｙｕａｎ，Ｓｈａｎｘｉ　０３００５１）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｆｒｕｃｔｏｓｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｗｉｎｅ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｉｓ　ｃｌｏｓｅｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕａｎｃｅ　ｏｆ　ａｎｄ／ｏｒ　ｕｎｓｈｅｅｒｎｅｓｓ　ｏｆ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｆｕｃｔｏｓｅ　ｕｔｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｉｓ　ｏｆ　ａ　ｇｒｅａｔ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ　ａｍｏｎｇ　ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ａ　ｈｉｇｈ　ｆｒｕｃｔｏｓｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｎｅ　Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＥＣ１　ｌ　１８　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ａｎ　ＨＸＴ３　ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋ—ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｔｗｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＨＸＴ３　ｅｌｌｅｌｅｓ　ｉｎ　ＥＣ１　１　１８．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＸＴ３　ｏｎ　ｔｈｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　ｆｒｕｃｔｏｓｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ’Ｓ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ，ａ　ｍｕｔａｔｅｄ　ＨＸＴ３－ｃｈａｍｐ　ｇｅｎｅ　ｈａｄ　ｐｌａｙｅｄ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｏｎ　ｐｒｏｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　ｔｏ　ｕｔｉｌｉｚｅ　ｈｉｇｈ　ｆｒｕｃｔｏｓｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｌａｔｅ　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅ—　ｓｕｉｔｓ　ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ　ａ　ｇｕｉｄｉｎｇ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｏｎ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｔｕｃｔｒｉｎｇ　ｉｆｎｅ　ｗｉｎｅ　ｙｅａｓｔ　ｗｉｔｈ　ｈｉ【ｇｈ　ｆｕｃｔｏｓｅ　ｕｔｒｉ－　ｌｉｚａｔｉｏｎ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ｆｕｃｔｏｓｅ　ｕｔｉｒｌｉｚａｔｉｏｎ；ｗｉｎｅ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；ＨＸＴ３　ａｌｌｅｌｅ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｒａｉｔ　酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ￣ｉａｅ）常常被筛　选作为葡萄酒酒精发酵菌种…。葡萄浆汁中葡萄　酒酵母利用葡萄糖的能力通常比利用果糖的能力　强　。有研究表明，酿酒酵母的低果糖利用能力　明Ｈｘｔｌ－７ｐ是酿酒酵母中发挥主要作用的转运蛋　白，对发酵条件下的葡萄糖和果糖的利用非常重　程中最稳定、最重要的转运体。。剖。酿酒酵母　糖和果糖含量基本相等，但在酒精发酵过程中，酿　要　’　。其中Ｈｘｔ３ｐ蛋白被认为是葡萄酒发酵过　ＦＥＲＭＩＣＨＡＭＰ通常能使葡萄酒发酵至干，具有较　与发酵后期低发酵速率和发酵不彻底密切相　强的果糖利用能力　ｌ９　Ｊ。通过分析该菌体ＨＸＴ己　关　。葡萄酒酿酒酵母葡萄糖和果糖利用差异　糖转运体的基因，发现该酵母菌具有突变的ＨＸＴ３　的分子基础研究是人们一直关注的问题。研究表　等位基因。ＥＣ１　１　１８也是常用的葡萄酒商业酿酒　基金项目：山西省回国留学人员科研资助项目（２０１３￣８８）；山西省青年科技研究基金（２０１２０２１０２７－３）　作者简介：赵文英女，博士，副教授。研究方向为葡萄酒微生物。Ｅ—ｍａｒｌ：ｚｚｒｌｚｗｙ２＠１６３．ｃｏｎ　收稿１３期：２０１４￣３—１９；修回日期：２０１４－０４—１９　１期　赵文英等：不同等位ＨＸＴ３基因对酿酒酵母ＥＣ１１１８发酵特性的影响　３１　酵母菌，与其他酿酒酵母菌相比，虽然产香特性较　有限公司。　差，但具有较高的果糖发酵能力，通常能使葡萄酒　１．１．２　培养基　ＹＰＤ培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖２０，　发酵至干，也能成功进行二次发酵接种，而且在前　酵母浸提物１０，蛋白胨２Ｏ。　期试验中也证实ＥＣ１　１　１８是具有高果糖利用能力　１．１．３　引物　根据ＧｅｎＢａｎｋ中报道的酿酒酵母　的葡萄酒酿酒酵母¨　。因此本研究以ＥＣ１１１８为　ＨＸＴ３的ＹＤＲ３４５Ｃ基因序列，设计一对同源臂片　试验材料，以探求其高果糖利用能力的分子基础。　段扩增引物Ｐ１和Ｐ２，用于以ＢＹ４７４３Ａｈｘｔ３敲除　１　材料与方法　菌为模板，ＰＣＲ扩增出含有ＫａｎＭＸ基因的片段。　在酿酒酵母染色体ＨＸＴ３基因同源重组区域外侧　１．１材料　和ＫａｎＭＸ基因内部，设计引物Ｐ３、Ｐ４，Ｐ５、Ｐ６用于　１．１．１　菌株葡萄酒商业用酿酒酵母ＥＣ１１１８，　检测重组菌株，即ＫａｎＭＸ基因置换ＨＸＴ３基因。　由新西兰奥克兰大学提供；ＢＹ４７４３Ａｈｘｔ３敲除菌，　设计引物Ｐ７、Ｐ８，扩增ＨＸＴ３等位基因片段，用于　包含有ＫａｎＭＸ基因片段，购自上海青兰生物科技　酶切和测序（见表１）。　表１实验所需引物　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ　ｌｉｓｔ　１．１．４　主要试剂ＴａｑＤＮＡ聚合酶、限制性内　Ｇ４１８的ＹＰＤ培养基上，２８℃培养３—５　ｄ，以筛选　切酶Ｒｓａ　Ｉ购于北京博迈德科技有限公司；ＰＣＲ　ＥＣｌ　ｌ　１８Ａｈｘｔ３敲除菌。挑选上述培养基上长出的数　引物由北京博迈德科技有限公司合成；１　ｋｂ　Ｍａｒｋ－　个单菌落，提取基因组，通过引物Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６进　ｅｒ为Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产品；ＤＮＡ片段纯化试剂盒、　行重组鉴定，获得ＥＣ１１１８Ａｈｘｔ３敲除菌。　酵母基因组ＤＮＡ提取试剂盒购于北京田恩泽基　１．２．３　ＥＣ１１１８Ａｈｘｔ３敲除茵中等位ＨＸＴ３基因　因科技有限公司；Ｇ４１８购于北京索莱宝公司；蛋　鉴别　以数个ＥＣ１１１８Ａｈｘｔ３敲除菌为出发菌，以　白胨、酵母粉为Ｏｘｏｉｄ公司产品；其余试剂均为国　Ｐ７、Ｐ８为引物，扩增另一个等位ＨＸＴ３片段。根　产分析纯。　据ＧｅｎＢａｎｋ中￥２８８ｃＨＸＴ３和ＦｅｒｍｉｃｈａｍｐＨＸＴ３　１．２方法　序列差异，设计和选用ＲｓａＩ内切酶对ＰＣＲ扩增产　１．２．１　酵母细胞培养、基因组提取和ＰＣＲ将酵　物通过酶切处理、电泳以区分ＰＣＲ扩增产物　母菌ＥＣ１１１８接人ＹＰＤ培养基中，２８℃、１８０　ｒ／　ＨＸＴ３基因的类型，并对扩增片段进行基因测序。　ｍｉｎ摇床震荡过夜培养。酿酒酵母培养物于ＹＰＤ　１．２．４发酵试验　将过夜培养的ＥＣ１１１８酵母　琼脂培养基上进行划线培养以检测纯度并获得单　菌及其不同等位基因敲除菌体，以１×１０。个细　菌落，并利用试剂盒进行酵母基因组ＤＮＡ的提　胞／ｍＬ的接种密度，接人８　ｍＬ模拟葡萄汁培养液　取。以ＢＹ４７４３Ａｈｘｔ３敲除菌为模板，Ｐ１、Ｐ２为引　中。将发酵管于ｌ８　ｏＣ，１３０　ｒ／ｍｉｎ摇床培养，以提　物，进行ＰＣＲ扩增，产物为具有ＨＸＴ３同源臂片　供充足的氧气。每日通过称量发酵管的重量，以　段的ＫａｎＭＸ基因片段。　跟踪发酵情况。同时吸取ｌ０　Ｌ发酵液置于ＰＣＲ　１．２．２敲除酵母茵ＥＣｌｌｌ８的ＨＸＴ３基因利用　管中，并直接加入９０　蒸馏水，稀释１Ｏ倍后，于　ＬｉＡｃ／ＳＳ载体ＤＮＡ／ＰＥＧ高效酵母转化方法进行同　１０～２Ｏ℃条件下冷冻保藏，以备测定葡萄糖、果　源重组基因置换。同源重组后，通过涂布在含有　糖浓度。每组发酵试验做３个重复，重量损失取　１期　赵文英等：不同等位ＨＸＴ３基因对酿酒酵母ＥＣ１１１８发酵特性的影响　３３　ｃｈａｍｐ菌的发酵情况明显有别于前两者。　ＥＣｌ１ｌ８△ｈｘｔ３－ｃｈａｍｐ菌前期启动发酵较早，发酵速　率较快，但后期发酵明显不足；ＥＣ１１１８Ａｈｘｔ３一ｎｏｒｍａｌ　菌前期发酵速率低，但发酵后期仍能保持强劲发酵。　１．Ｏ　∞０．８　０．６　坷硎０．４　Ｏ．２　Ｏ．０　Ｏ　ｌ　２　３　４　５　６　７　８　９　ｔ／ｄ　图３　ＥＣｌｌｌ８ＨＸＴ３等位基因敲除菌的发酵曲线　Ｆｉｇ；３　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ＨＸＴ３　加　∞ａｌｌｅｌｅｓ　ｄｅｌ踟　∞　∞ｅｔｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ加　ｆｒｏｍ　ＥＣ１Ｏ　　１　１８　２．５葡萄糖、果糖的测定曲线　为探寻不同ＨＸＴ３等位基因对单糖利用的　影响，对各菌葡萄糖和果糖的利用情况进行连　续测定。由图４、５可知，葡萄糖的消耗速率　明显大于果糖的利用速率。在迅速生长期，具　有ＨＸＴ３一ｎｏｒｍａｌ基因的ＥＣ１１１８Ａｈｘｔ３．ｃｈａｍｐ菌　葡萄糖的消耗速率高，而具有ＨＸＴ３．ｃｈａｍｐ基　因ＥＣ１１１８Ａｈｘｔ３．ｎｏｒｍａｌ菌和ＥＣ１１１８菌，葡萄　糖的消耗速率接近，并低于ＥＣ１１　１８Ａｈｘｔ３一　ｃｈａｍｐ菌；在发酵后期，具有ＨＸＴ３．ｎｏｒｍａｌ基　因的ＥＣ１１１８Ａｈｘｔ３一ｃｈａｍｐ菌果糖利用能力明显　变弱，ＥＣ１１１８Ａｈｘｔ３一ｎｏｒｍａｌ菌和ＥＣ１１１８果糖　利用能力基本相同，且明显强于ＥＣ１　１　１８Ａｈｘｔ３－　ｃｈａｍｐ菌，并能基本做到果糖的彻底利用。这　说明如果ＥＣ１１１８菌中只保留了ＨＸＴ３一ｎｏｒｍａｌ　基因，则具有强烈的葡萄糖偏好性，尤其在发　酵后期果糖利用能力低。而只保留了突变的　ＨＸＴ３．ｃｈａｍｐ基因的菌体，则可增强菌体发酵　后期对果糖的利用能力。而ＥＣ１１１８由于发酵　情况接近于ＥＣ１１１８Ａｈｘｔ３一ｎｏｒｍａｌ菌，因此可推　测ＥＣ１１１８菌在发酵过程中主要启动了ＨＸＴ３一　ｃｈａｍｐ基因的表达。由此可见，该突变的　ＨＸＴ３．ｃｈａｍｐ基因对保证菌体彻底发酵起到重　要的作用。　＝．、　、一　二　爨　搬　｛Ｉ蕃　、√　０　１　２　３　４　５　６　７　８　ｔ／ｄ　图４　ＥＣｌｌｌ８ＨＸＴ３等位基因敲除菌　的葡萄糖利用曲线　Ｆｉｇ．４　Ｇｌｕｃｏｓｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ＨＸ１　ａ】】ｅｌｅＳ　ｄｅｌｅｔｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ＥＣｌ】】８　岛　一　、　～　磬　、　图５　ＥＣｌｌｌ８ＨＸＴ３等位基因敲除菌的果糖利用曲线　Ｆｉｇ．５　Ｆｒｕｃｔｏｓｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ＨＸＴ３　ａｌｌｅｌｅｓ　ｄｅｌｅｔｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ＥＣ１　１　１８　３　讨　论　ＥＣＩ１１８是具有较高果糖利用能力的杂合菌，　本研究以ＥＣｌｌ１８为试材，利用重组技术敲除　ＨＸＴ３基因，敲除菌的鉴定结果首次发现ＥＣ１１１８　具有２个不同的ＨＸＴ３等位基因。其中的一个等　位基因与实验室酵母菌Ｓ２８８ｃＨＸＴ３序列一致，称　为ＨＸＴ３．ｎｏｒｍａｌ等位基因；另一个等位基因与葡萄　酒商业酿酒酵母菌ＦＥＲＭＩＣＨＡＭＰ中发现的突变　的ＨＸＴ３序列一致，称为ＨＸＴ３－ｃｈａｍｐ等位基因。　酿酒酵母ＦＥＲＭＩＣＨＡＭＰ通常能使葡萄酒发　酵至干，具有较强的果糖利用能力　。通过分　析该菌体ＨＸＴ己糖转运体的基因，发现该酵母菌　具有突变的ＨＸＴ３基因。通过在ｈｘｔｌ＿７△全缺陷　菌体中的表达该ＨＸＴ３突变基因，发现该基因具　有高果糖的利用能力。推测该基因对ＦＥＲ－　ＭＩＣＨＡＭＰ发酵过程中的葡萄糖／果糖比值变化　３４　微生物学杂志　３５卷　起着重要作用　Ｊ。Ｎｏｖｏ等　在ＥＣ１１１８基因测　序过程中并没有提到ＥＣ１１１８中ＨＸＴ３基因的特　殊性。　本研究不仅首次发现ＥＣ１１１８具有２个不同　的ＨＸＴ３等位基因，且研究了不同ＨＸＴ３等位基　因缺失对菌体发酵过程中葡萄糖、果糖利用的影　响。结果表明，ＥＣ１１１８中ＨＸＴ３一ｎｏｒｍａｌ等位基因　的缺失，对ＥＣ１１１８的发酵没有明显影响，只是发　酵启动略慢些；而ＥＣ１１１８中ＨＸＴ３．ｃｈａｍｐ等位基　因的缺失，会造成发酵后期动力不足，尤其在发酵　后期果糖利用能力低；而只保留了突变的ＨＸＴ３一　ｃｈａｍｐ基因的菌体，则具有菌体发酵后期高果糖　的利用能力，而ＥＣ１１１８由于发酵情况接近于　ＥＣ１　１　１８Ａｈｘｔ３一ｎｏｒｍａｌ菌，因此可推测ＥＣ１　１　１８菌在　发酵过程中主要启动了ＨＸＴ３．ｃｈａｍｐ基因的表　达。由此可见，该突变的ＨＸＴ３一ｃｈａｍｐ基因对保　证菌体彻底发酵起到了重要的作用。　Ｎｏｖｏ等　在ＥＣ１１１８中鉴定出了ＦＳＹ１基　因，该基因与巴斯德酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐａｓｔｏｒｉａ—　ｎｕｓ）中的果糖转运体ＦｓｙｌＰ的基因序列具有同源　性。Ｇａｌｅｏｔｅ等¨　认为通过菌种问水平基因转移　获得的ＦＳＹ１对ＥＣ１１１８的高果糖利用能力可能　有贡献。利用ｈｘｔ１．７Ａ全缺陷的菌体来表达该基　因后，结果表明，ＦＳＹ１对果糖具有高亲和性，且乙　醇可诱导其表达。Ｌｉｎ等　在分析有氧发酵酵母　和有氧呼吸酵母的转运蛋白基因组成时，发现己　糖转运蛋白基因拷贝数与有氧发酵强度具有强烈　正相关性，即转运蛋白基因拷贝数的增加有助于　酿酒酵母向有氧发酵方向进化。后续研究中，将　通过敲除ＥＣ１１１８中的ＦＳＹ１基因，在保证基因背　景一致的前提下，探讨Ｉ］＇ＸＴ３．ｃｈａｍｐ基因和ＦＳＹ１　基因在菌体发酵后期对果糖利用影响的差异。　参考文献：　＋Ｉ　，［１］Ｄｕｍｏｎｔ　Ａ，Ｒａｙｎａｌ　Ｃ，Ｒａｇｉｎｅｌ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｗｉｎｅ　ｙｅａｓｔ　ｔｏ　ｃｏｎｓｕｍｅ　ｆｒｕｃｔｏｓｅ［Ｊ］．Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ　ａｎｄ　Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　ｇｒａｐｅｇｒｏｗｅｒ　ａｎｄ　ｗｉｎｅｍａｋｅｒ，２００９，５４３：５２－５７．　［２］　Ａｒｒｏｙｏ—Ｌｏｐｅｚ　Ｎ，Ｑｕｅｒｏｌ　Ａ，Ｂａｒｒｉｏ　Ｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｕｂ—　ｓｔｒａｔｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ　ｔｏ　ｅｓｔｉｍａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｆｕｒｃｔｏｓｅ　ｃｏｎｃｅｎ．　ｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｄｉｖｅｒｓｅ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ￣ｉａｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　［Ｊ］．Ｊｏｕｍａｌ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｉｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｙｇ，２００９，　３６：６６３－６６９．　［３］　陈莹，屈慧鸽，Ｇａｆｂｅｒ　Ｊ．葡萄糖一果糖比对发酵停滞的影响　及其预防、重启策略［Ｊ］．中外葡萄与葡萄酒，２０１０，（５）：６９—　７１．　［４］Ｂｅｒｔｈｅｌｓ　Ｎ．Ｊ，Ｃｏｒｄｅｒｏ　Ｏｔｅｒｏ　Ｒ．Ｒ，Ｂａｕｅｒ　Ｆ．Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｓｃｒｅｐ．　ａｎｃｙ　ｉｎ　ｕｃ０ｓｅ　ａｎｄ　ｆｒｕｃｔｏｓｅ　ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｌａｉａｅ　ｗｉｎｅ　ｙｅａｓｔ　ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．ＦＥＭＳ　Ｙｅａａｔ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，４：６８３－６８９．　［５］Ｚｉｎｎａｉ　Ａ，Ｖｅｎｔｕｒｉ　Ｆ，Ｓａｎｍａｒｔｉｎ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　ｄ－ｆｒｕｃｔｏｓｅ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏ—　ｍｏｔｅｄ　ｂｙ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１３，１１５：４３－４９．　［６］　Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ　Ｃ，Ｄｅｌｏｂｅｌ　Ｐ，Ｓａｂｌａｙｒｏｌｌｅｓ　ＪＭ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂａ—　ｓｉｓ　ｏｆ　ｆｕｒｃｔｏｓｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｗｉｎｅ　ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ—　ｓｉａｅ：ａ　ｍｕｔａｔｅｄ　ＨＸＴ３　ａｌｌｅｌｅ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ＆Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。２００７，７３：　２４３２－２４３９．　［７］　Ｋａｒｐｅｌ　ＪＥ，Ｐｌａｃｅ　ＷＲ，Ｂｉｓｓｏｎ　ＬＦ．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｈｅｘ－　ｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｗｉｎｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　［Ｊ］．Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｍａｉ　ｏｆ　Ｅｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｖｉｔｉｅｕｌｔｕｒ￣，２００８，５９：　２６５－２７５．　［８］Ｌｉｎ　Ｚ，Ｌｉ　ＷＨ．Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｘｏｓｅ　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　Ｇｅｎｅｓ　Ｗａｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｅｒｏｂｉｃ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔｓ　［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２０１１，２８；ｔ３１－１４２．　［９］Ｌｉｃｃｉｏｌｉ　Ｔ，Ｃｈａｍｂｅｒｓ　ＰＪ，Ｊｉｒａｎｅｋ　Ｖ．Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ　ｉｎｄｅ—　ｐｅｎｄｅｎｔ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｆｏｒ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｍｃｔｏｐｈｉｌｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　Ｗｉｎｅ　ｙｅａｓｔ　ｓｔ／ａｉｎｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＩｎｄｕｓｔｉｆＭ　Ｍｉｃｒｏ—　ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１。３８（７）：８３３—８４３．　［１０］赵文英，贾万利，高莉．等．葡萄酒酿酒酵母嗜果糖特性的评　价方法［Ｊ］．微生物学通报，２０１３，４０（６）：１０２７－１０３２，　［１　１］Ｎｏｖｏ　Ｍ．，Ｂｉｇｅｙ　Ｆ．，Ｂｅｙｎｅ　Ｅ．，ｅｔ　ａ１．Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ—ｔｏ－ｅｕｋａｒｙｏｔｅ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｅｖｅｎｔｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｉｎｅ　ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｕｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＥＣ１　１　１８［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ，２００９，１０６：１６３３３—　１６３３８．　［１２］Ｇａｌｅｏｔｅ　Ｖ，Ｎｏｖｏ　Ｍ，Ｓａｌｅｍａ－Ｏｏｍ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．ＦＳＹ１，ａ　ｈｏｒｉｚｏｎ—　ｔｌａｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＥＣ１　１　１８　ｗｉｎｅ　ｙｅａｓｔ　ｓｔｒａｉｎ，ｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｈｉｇｈ—ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｆｕｒｃｔｏｓｅ／Ｈ　ｓｙｍｐｏｒｔ—　ｅｒ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１５６（Ｐｔｌ２）：３７５４－３７６１．