H3N8亚型EIVHA基因在昆虫细胞中的表达及生物学特性分析

2024-07-29 作者:

第３５卷第１１期　中国预防兽医学报　ＶＯ１．３５．Ｎｏ．１１　２０１３年１１月　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ＮＯＶ．　２０１３　ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００８—０５８９．２０１３．１　１．１７　Ｈ３Ｎ８亚型ＥＩＶ　ＨＡ基因在昆虫细胞中的表达　及生物学特性分析　刘春国　，王　伟　，刘　飞ｚ，刘彦云　，王　丹３　吕　让　，刘　明　，相文华　（１．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨１５０００１；　２．中国农业科学院上海兽医研究所，上海２００２４１；３．黑龙江省医院，黑龙江哈尔滨１５０００１）　摘　要：为表达Ｈ３Ｎ８亚型马流感病毒（ＥｌＹ）ＨＡ蛋白，本研究将Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／ｘｉｎｊｉａｎｇ／３／２００７（Ｈ３Ｎ８）　ＨＡ基因克　隆至杆状病毒转移载体ｐＦａｓｔＢａｃｌ中，构建重组转移质粒ｐＦＢ－ＸＪ３一ＨＡ，并将其转化至ＤＨ１０ＢＡＣ感受态细胞中，　与杆状病毒骨架质粒Ｂａｃｒｎｉｄ进行重组，重组杆粒ｒＢａｃ．ＸＪ３．ＨＡ转染Ｓｆ９昆虫细胞，构建重组杆状病毒　ｒＢｖ．ＸＪ３．ＨＡ，并通过细胞免疫组化和ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ进行鉴定。结果表明ｒＢｖ—ＸＪ３．ＡＨ构建正确，表达的ＨＡ蛋白与　抗ＥＩＶ的血清反应良好；血凝试验结果表明表达的ＨＡ蛋白具有良好的血凝活性。本研究为研制ＥＩＶ　ＨＡ蛋白亚　单位疫苗提供了实验依据。　关键词：马流感病毒；Ｈ３Ｎ８亚型；ＨＡ基因；杆状病毒表达；血凝活性　中图分类号：￥８５２．６５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８。０５８９（２０１３）１１－０９３４．０３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ＣｈａｒａＣｔｅｒｉｚａｔｉＯｎ　Ｏｆ　ＨＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｈ３Ｎ８　ｓｕｂｔｙｐｅ　ｅｑｕｉｎｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎ　ｉｎｓｅｃｔ　ｃｅｌｌｓ　ＬＩＬＴ　Ｃｈｕｎ—ｇｕｏ　，ＷＡＮＧ　Ｗｅｉ　，ＬＩＵ　Ｆｅｉ　，ＬＩＵ　Ｙａｎ—ｙｕｎ　，ＷＡＮＧ　Ｄａｎ　，ＬＶ　Ｒａｎｇ　，　ＬＩＵ　Ｍｉｎｇ　．ＸＩＡＮＧ　Ｗｅｎ—ｈｕａ　（１．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｂｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｈａｒｂｉｎ　１５０００１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４１，Ｃｈｉｎａ　３　Ｈｅｉｌｏｎｇｉｉａｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈａｒｂｉｎ　１５０００１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＡ）ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｈ３Ｎ８　ｓｕｂｔｙｐｅ　ｅｑｕｉｎｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ（ＥＩＶ），ｔｈｅ　ＨＡ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｅ１Ｖｓ　Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／ｘｉｎｊｉａｎｇ／３／２００７（Ｈ３Ｎ８）ｗａｓ　ｓｕｂ—ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＦａｓｔＢａｃ　１　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｈｕｔｔｌｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＦＢ—ＸＪ３一ＨＡ　ｗａｓ￣ａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　ＤＨ１０ＢＡ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｂａｃｍｉｄ　ｏｆ　ｒＢａｃ．ＸＪ３．ＨＡ．Ｔｈｅ　ｒＢａｃ—ＸＪ３一ＨＡ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｓｆ９　ｉｎｓｅｃｔ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ｐａｃｋｉｎｇ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｏｆ　ｒＢｖ—ＸＪ３．ＨＡ　ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ，ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｗｅｓｔｅｍ　ｂｌｏｔ，ａｎｄ　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＨＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＥＩＶ　ｗａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｉｎｓｅｃｔ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｈａｖｅ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｏｆ　Ｈ３Ｎ８　ｓｕｂｔｙｐｅ　ｅｑｕｉｎｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｅｑｕｉｎｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ；Ｈ３Ｎ８　ｓｕｂｔｙｐｅ；ＨＡ　ｇｅｎｅ；ｂａｃｕｌｏｖｉｍｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ　收稿日期：２０１２．１１－０８　作者简介：刘春Ｎ（１９７８一），男，湖南茶陵人，助理研究员，博士，主要从事动物流感病毒研究　通信作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｍｉｎｇ０４＠１２６．ｃｏｍ；ｘｉａｎｇｗｅｎｈｕａｌ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃａ　第ｌ１期　刘春国，等．Ｈ３Ｎ８亚型ＥＩＶ　ＨＡ基因在昆虫细胞中的表达及生物学特性分析　９３５　马流感（Ｅｑｕｉｎｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ＥＩ）是由正黏病毒科流　感病毒属Ａ型流感病毒中的ＥＩ病毒（Ｅｑｕｉｎｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ，ＥＩＶ）引起的马属动物一种严重的上　测序用引物及Ｍ１３通用引物参照Ｂａｃ．ｔｏ—Ｂａｃ杆状病　毒表达系统说明书，引物由上海英骏生物技术有限　公司合成。　１．４重组杆状病毒转移载体的构建参照文献［６］　的方法提取ＥＩＶ　ＲＮＡ及制备ｃＤＮＡ。以ｃＤＮＡ为模　呼吸道急性高度接触性传染疾病，多呈暴发性流　行，传播迅速而且广泛，给养马业及赛马业造成严　重的经济损失【Ｉ＿２】。近几年来ＥＩ在世界各地频繁暴　板，采用弓１物ＸＪ３一ＨＡＦ和ＸＪ３．ＨＡＲ进行ＰＣＲ扩增　ＨＡ基因，产物纯化后用Ｘｈｏ　Ｉ和Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ进行双酶　发，我国２００７年～２０１１年间在多个省市也暴发了　ＥＩ疫情【３Ｊ。ＥＩＶ不仅可以感染马和驴等马属动物，　切，并将其克隆于ｐＦａｓｔＢａｃｌ中构建重组转移质粒　甚至可以感染犬和猪［４－５］，ＥＩＶ跨越种间障碍感染其　它哺乳动物，也给公共卫生带来极大的安全隐患。　因此，对ＥＩ进行监测和防控是重点。而我国目前还　没有自主研发的商品化诊断试剂或疫苗用于ＥＩ的临　床诊断或防制。　本研究将我国ＥＩＶ代表株Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／ｘｉｎｊｉａｎｇ／　３／２００７（Ｈ３Ｎ８）的ＨＡ基因重组于杆状病毒载体中，　利用昆虫细胞表达ＨＡ蛋白，并对ＨＡ蛋白的生物　学特性进行检测，为基于ＨＡ蛋白诊断方法的开发　以及ＨＡ亚单位疫苗的研制提供技术储备。　１材料和方法　１．１　病毒株、载体、细胞和菌株ＥＩＶ　Ａ／ｅｑｕｉｎｅ／　ｘｉｎｊｉａｎｇ／３／２００７（Ｈ３Ｎ８）、杆状病毒转移载体　ｐＦａｓｔＢａｃｌ、Ｓｆ９昆虫细胞以及ＤＨ１０Ｂａｃ和Ｔｏｐｌ０感　受态细胞均由本实验室构建保存。　１．２主要试剂限制性内切酶、ＡＭＶ反转录酶、　ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｅｘ　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、Ｔ４　ＤＮＡ连接　酶购自ＴａＫａＲａ公司；Ｔｒａｎｓ　２Ｋ　ｐｌｕｓ　ＩＩ　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　购自北京全式金生物技术有限公司；预染蛋白　Ｍａｒｋｅｒ购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；病毒ＲＮＡ提取试剂　盒、质粒ＤＮＡ小量提取试剂盒、ＤＮＡ胶回收试剂　盒以及ＰＣＲ纯化试剂盒均购自Ａｘｙｇｅｎ公司；　Ｇｒａｃｅ’Ｓ昆虫细胞培养基购自Ｇｉｂｃｏ公司；Ｉｎｓｅｃｔ　Ｇｅｎｅ　Ｊｕｉｃｅ转染试剂购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司；小鼠抗ＥＩＶ　／Ａｅｑｕｉｎｅ／ｘｉｎｊｉａｎｇ／３／２００７（Ｈ３Ｎ８）特异性多克隆抗血清　由本实验室制备保存；ＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ　ｆＩｇＧ—ＨＲＰ）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。　１．３引物的设计与合成根据Ｈ３Ｎ８亚型ＥＩＶ　ＨＡ　基因序列设计ＨＡ基因特异性引物，ＸＪ３．ＨＡＦ：　５＇－ＣＣ　△　ＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣ－３’（Ｘｈｏ　Ｉ），ＸＪ３－　ＨＡＲ：５＇－ＣＣＣ丛　！！ＣＴＡＴＣＡＧＴＴＴＡＣ一３（Ｈ／ｎｄ　ＩＩＩ）。　反转录通用引物Ｕｎｉ．１２：５＇－ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧ．．３，　ｐＦＢ．ＸＪ３．ＨＡ，并进行测序鉴定。　１．５　重组转座子的构建　将ｐＦＢ—ＸＪ３．ＨＡ按照　Ｂａｃ．ｔｏ．Ｂａｃ杆状病毒表达系统说明书转化ＤＨ１０Ｂａｃ　感受态细胞，与Ｂａｃｍｉｄ进行重组。筛选重组杆粒　ｒＢａｃ—ＸＪ３．ＨＡ，利用Ｍ１３通用引物进行ＰＣＲ鉴定。　１．６　重组杆状病毒的制备　将ｒＢａｃ—ＸＪ３．ＨＡ和　Ｂａｃｍｉｄ按照转染试剂操作说明分别转染Ｓｔ９细胞。　待细胞病变达到约８０％后收集上清液作为第１代种　毒，经过４次连续传代后筛选得到高滴度含有ＨＡ　基因的重组杆状病毒ｒＢＶ—ＸＪ３．ＨＡ和野生型杆状病　毒（ｗｔＢＶ）。　１．７细胞免疫组织化学法检测蛋白的表达将第５　代ｒＢＶ．ＸＪ３．ＡＨ和ｗｔＢＶ分别接种培养于６孔板中的　Ｓｆ９细胞进行免疫组织化学试验［７］。以小鼠抗Ｈ３Ｎ８　亚型ＥＩＶ特异性多克隆抗血清（１：２００）作为一抗，以　羊抗鼠ＩｇＧ—ＨＲＰ（１：２　ｏｏｏ）为二抗，ＤＡＢ显色，显微　镜下观察结果。　１．８　ＨＡ蛋白的ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析　取第５代　ｒＢＶ．ＸＪ３．ＨＡ和ｗｔＢＶ分别接种Ｓｆ９细胞，２７℃培养　７２　ｈ后收获细胞，将细胞裂解物进行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ，　随后将蛋白转印于ＮＣ膜上。经５％脱脂乳封闭，　以小鼠抗Ｈ３Ｎ８亚型ＥＩＶ多克隆抗血清为一抗，羊　抗鼠ＩｇＧ—ＨＲＰ为二抗，进行ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ鉴定ｆ８１。　１．９　重组蛋白的血凝活性检测　分别取第５代　ｒＢＶ．ＸＪ３．ＡＨ和ｗｔＢＶ感染Ｓｆ９细胞，培养７２　ｈ后分　别收获细胞和细胞培养上清液，细胞经ＰＢＳ洗涤３　次后超声裂解，用０．５％的鸡红细胞对细胞培养上　清液和裂解的细胞进行红细胞凝集试验。　２结果与讨论　２．１　重组杆状病毒转移载体的构建将构建的重　组穿梭质粒ｐＦＢ．ＸＪ３．ＨＡ用Ｘｈｏ　Ｉ和Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ双酶切　鉴定得到４．８　ｋｂ的载体片段和１．７　ｋｂ的ＨＡ基因片