人乳头瘤病毒18型E6蛋白真核表达载体的构建及其在子宫颈癌细胞株Hela

2024-07-29 作者:

中国实验诊断学２０１０年２月第１４卷第２期　～１５９一　文章编号：１００７—４２８７（２０１０）０２—０１５９—０３　人乳头瘤病毒１　８型Ｅ６蛋白真核表达载体的构建　及其在子宫颈癌细胞株Ｈｅｌａ细胞中的表达　卫莹，朱靖，王青元，范少君，李敏，肖卫华，凌斌，周　颖　（１．安徽医科大学附属省立医院妇产科分子实验室安徽省分子医学重点实验室，安徽合肥２３０００１；　２．中国科技大学生命科学院免疫学研究所）　摘要：目的构建并鉴定ｐ３×ｆｌａｇ－ｍｙｃ—ＣＭＶ一２４．ＨＰＶ１８Ｅ６真核表达载体，并转染Ｈｅｌａ细胞后，检测其在Ｈｅｌａ细胞　中的表达。方法用ＲＴ－ＰＣＲ法从Ｈｅｌａ细胞中扩增出带ＨｉｎｄＩＩ、Ｓａｌ　Ｉ酶切位点的ＨＰＶ１８Ｅ６基因片段，将ＨＰＶ１８Ｅ６基　因片段连接到ｐＭＤ　１８Ｔ载体上，通过限制性内切酶Ｈｉｎｄ１］／、Ｓａｌ　Ｉ酶切，Ｔ４连接酶连接到含有上述酶切位点的ｐ３×ｆｌａｇ－　ｍｙｃ．ＣＭＶ－２４真核表达载体上，通过脂质体将ｐ３×ｆｌｇａ－ｍｙｅ—ＣＭＶ．２　ＨＰＶ１８Ｅ６转染入Ｈｅｌａ细胞４８　ｈ后，Ｗｅｓｔｅｍ．ｂｌｏｔ检　测ＨＰＶ１８Ｅ６及３×ｆｌｇａ表达情况。结果ｐ３×ｆｌｇａ－ｍｙｃ－ＣＭＶ－２４一ＨＰＶ１８Ｅ６真核表达载体构建成功，构建的真核表达载　体可以被限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ、ＳａｌＩ切开，电泳可显示相应条带，经测序其序列与设计的一致，转染到Ｈｅｌａ细胞４８　ｈ　后经Ｗｅｓｔｅｎｒ－ｂｌｏｔ检测可见ＨＰＶ１８Ｅ６的高表达及ｆｌｇａ的表达。结论ｐ３×ｆｌａｇ－ｍｙｃ—ＣＭＶ－２４　ＨＰＶ１８Ｅ６真核表达载体的成　功构建为进一步研究ＨＰＶ１８Ｅ６的致癌机制奠定了基础。　关键词：Ｈｅｌａ细胞；真核表达载体；ＨＰＶ１８Ｅ６；ｌｆｇａ　中图分类号：Ｒ７３０．２３１　文献标识码：Ａ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆｐ３×ｆｌａｇ－ｍｙｃ－ＣＭＶ－２４－ＨＰＶ１８Ｅ６ｆｕｓｉｏｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄｉｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＨｅｌａＣｅｌｌｓ　ＷＥＩＹｉｎｇ，　ＺＨＵ　，ＷＡＮＧＱｉｎｇ－ｙｕａｎ，ｅｔ　ａ１．（Ｍｏ＆ｃ￣ａｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＯｂｓｔｅｒｉｃｓ　ａｎｄＧｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，ＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＨｏｓｐｉｔａｌ　一　ｅｄ　ｔｏ　Ａｎｈｕｉ　ｍｅｄｉｃｌａ　ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ　２３０００１，Ｃｈ／，￣）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｐ３×ｆｌａｇ－ｍｙｃ—ＣＭＶ一２４一ＨＰＶ１８Ｅ６　ｆｕｓｉｏｎ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｔｅｓｔ　ｉｔｓ　ｅｘ—　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｈｅｌａ　ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｍ　１８Ｅ５　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　Ｈｉｎｄ］］Ｉ　ａｎｄ　Ｓａｌ工ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｃｕｔｔｉｎｇ　ｓｉｔｅ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｏｆ　Ｈｅｌａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ｂｙ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ＰＣＲ），ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ＨＰＶ１８Ｅ６　ｇｅｎｅ　ｓｅｕｑｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｉｎ—　ｓｅ￣ｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＭＤ－１８Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ．Ａｆｔｅｒ　ｅｎｚｙｍｅ　ｃｕｔｔｉｎｇ　ｂｙ　ＨｉｎｄⅢａｎｄ　Ｓａｌ　Ｉ，ｕｓｅ　Ｔ４　ｌｉｇａｓｅ　ｔｏ　ｆｏｒｍ　ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐ３×　ｌｆａｇ－ｍｙｃ—ＣＭＶ一２４一ＨＰＶ１８Ｅ６．Ｔｈｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐ３×ｆｌａｇ－ｍｙｃ—ＣＭＶ－２４一ＨＰＶ１８Ｅ６　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　Ｈｅｌａ　ｃｅｌｌｓ．Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｔｅｓｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｌｆｇａ　ａｎｄ　ＨＰＶ１８Ｅ６　ａｆｔｅｒ　４８　ｈ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｐ３×ｆｌｇａ－ｍｙｅ－ＣＭＶ一２４一Ｉ－ＩＰＶ１８Ｅ６　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓ—　ｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｓｅｅｎ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｆｌｇａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｅｕ—　ｋａｒｙｏｔｉｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ＨＰＶ１８　Ｅ６　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｉｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｅ６　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｒｒｅｃｄｙ　ｉｎ　Ｈｅｌａ　ｃｅＨｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｈｅｌａ　ｃｅＨ；ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ；ＨＰＶ１８　Ｅ６；ｆｌａｇ　（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ脚ｚ，２０１０，１４：０１５９）　人乳头状瘤病毒（ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍｓ，ＨＰＶ）持　实验基础。　续感染是宫颈癌发生的最重要危险因素之一，高危　１材料和方法　型ＨＰＶ，如ＨＰＶ１６和ｌ８的感染在宫颈癌中最常见，　１．１材料总ＲＮＡ提取试剂Ｔｒｉｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　其Ｅ６基因及产物常常导致细胞基因失活、变异和异　公司，逆转录试剂盒购自ＴａｋａＲａ公司，ＤＥＰＣ购自　常表达，最终诱导官颈上皮细胞永生化，是最主要的　Ｓｉｇｍａ公司，ＴａｑＤＮＡ聚合酶购自ＴａｋａＲａ公司，　癌蛋白编码基因＿１ｊ。近年来对Ｅ６蛋白的研究逐步　ｐＭＤＴＭ１８．Ｔ　Ｖｅｃｔｏｒ购自ＴａＫａＲａ公司，小剂量质粒提　深入，但是Ｅ６蛋白在子宫颈癌细胞株中的表达水平　取试剂盒购自Ａｘｙｇｅｎ公司，限制性内切酶Ｈｉｎ（ｊⅢ、　很低，很难检测＿２ｊ。本文将ＨＰＶ１８Ｅ６基因克隆到３　Ｓａｌ工及ＤＮＡ连接酶均购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，大肠肝　×ｆｌａｇ真核表达载体上，构建重组质粒ｐ３×ｆｌｇａ．ｍｙｃ．　菌菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ购自上海生工生物工程有限公　ＣＭＶ．２４．ＨＰＶ１８Ｅ６，经鉴定后转染到Ｈｅｌａ细胞中，为　司，脂质体转染试剂盒Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、ＤＭＥＭ培　进一步研究ＨＰＶ１８Ｅ６在宫颈癌发病中的作用奠定　养基、胎牛血清购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，ＨＰＶ１８Ｅ６抗体　购自ｓａｎｔａ　ＣＹｔｌＺ公司，ＧＡＰＤＨ抗体购自Ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　基金项目：安徽省自然科学基金项目（编号：０９０４１３１１７）　＊通讯作者　公司，ｆｌｇａ抗体购自ｓｉｇｍａ公司，Ｗｅｓｔｅｒｎ．ｂｌｏｔ化学发　一ｌ６０一　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｎａ，Ｆｅｂ，２０１０，Ｖｏｌ　１４，Ｎｏ．２　光底物购自ＰＩＥＲＣＥ公司。　１　．２方法　行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳，再电转到ＰＶＤＦ膜上，经封闭２　小时后一抗ｆｌｇ（１：１ａ　０００）或ＧＡＰＤＨ（１：１　０００）或　１．２．１　ｐ３　ｘ　ｆｌａｇ－ｍｙｃ－ＣＭＶ．２４．ＨＰＶ１８Ｅ６真核表达载　ＨＰＶ１８Ｅ６（１：５ｏ）４℃过夜，ＴＢＳ．Ｔ洗后加入相应的二　抗孵育２小时，膜经ＴＢＳ＇Ｔ洗后与ＥＣＬ发光检测剂　结合，经ｘ片压片曝光，显示结果。　２结果　体的构建及鉴定　参考ＧｅｎＢａｎｋ中ＨＰＶ１８Ｅ６碱基　序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０软件进行分析后设计　出１８Ｅ６上下游引物：Ｐ１：ＧＣＧＣＧＣＴＩＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡ；　Ｐ２：ＴｒＡＴＡＣＴ１Ｖ，Ｔ　ＧＴＩＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＧ　Ｆｗｌ：ＣＣＣａａｇｃｔｔ　２．１　Ｉ－ＩＰＶ１８Ｅ６的Ｐ　产物电泳结果ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ　ＧＣＧＣＧＣＴＩＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡ（Ｈｉｎｄ　ｍ）；Ｒｖｌ：ＧＣＧＴＣ—　为ＤＬ２０００标准参照物，ＰＣＲ产物琼脂糖凝胶电泳显　ＧＡＣ　ＴＡＣＴＩＧＴＧ　１１ＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＧ（Ｓａｌ工）；分别加入　了Ｈｉｎｄｍ、Ｓａｌ工酶切位点（划线部分）。用Ｔｒｉｚｏｌ法　从Ｈｅｌａ细胞中提取总ＲＮＡ，以Ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）１８为逆转　录引物，以提取的总ＲＮＡ为模板，在Ｍ．ｍｌｖ反转录　示在５００　ｂｐ的一条特异性目的片段，与所设计的　ＨＰＶ１８Ｅ６目的基因片段大小一致（图１）。　酶催化下反转录出ｃＤＮＡ。取２　ｃＤＮＡ为模版，采　用Ｔａｋａｒａ　Ｅｘ　ＴａｑＤＮＡ聚合酶进行ＰＣＲ，扩增目的基　因。反应条件：９４℃５　ｍｉｎ　１个循环，９４℃３０　Ｓ，５５℃　３０　ｓ，７２ｃＩ＝３０　ｓ共３５个循环，７２℃１０　ｍｉｎ　１个循环。　取１５　ｌ　ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶中电泳。依据　ＴａＫａＲａ胶回收纯化试剂盒操作规程，胶回收纯化目　２　０００　１　０００　７５０　５００　２５０　１００　的片段，回收成功后将目的片段连接到ｐＭＤ．１８Ｔ载　体中，转化后提取质粒测序鉴定正确后，以ｐＭＤ－　１８Ｔ　１８Ｅ６为模板，经Ｆｗ１，Ｒｖｌ引物扩增得到编码区　图１　ＨＰＶ１８Ｅ６目的基因片段电泳图　２．２　ｐ３×ｆｌａｇ—ｍｙｅ－ＣＭＶ．２４－ＨＰＶ１８Ｅ６重组质粒酶　切鉴定、测序经ＨｉｎｄⅢ和Ｓａｌ　Ｉ双酶切后出现分子　片段。将１８Ｅ６编码区片段与载体分别用Ｈｉｎｄ　ｎｌ、　Ｓａｌ工酶切，胶回收获得载体片段和ＨＰＶ１８Ｅ６片段，　量分别为４　７００　ｂｐ和５００　ｂｐ的２条带，正好与质粒　ｐ３×ｆｌａｇ．ｍｙｃ．ＣＭＶ　２４和ＨＰＶ１８　Ｅ６基因的分子量一　致（图２）。将重组质粒ｐ３×ｆｌｇ．ａｍｙｃ．ＣＭＶ．４一２　然后用ＤＮＡ连接酶，２０℃连接过夜，将连接产物转　化进ＤＨ５ｃｔ感受态大肠杆菌，涂板（氨苄霉素抗性），　３７￣（２生长１６　ｈ一２４　ｈ，长出菌斑约１００个，挑出１４个　ＨＱＶ１８Ｅ６送到上海生工生物有限公司测序，测序结　果均与目的序列完全相同，表明构建载体成功。　菌斑溶于ｔ　ｍｌ氨苄霉素抗性的ＬＢ培养基中少量摇　菌１２　ｈ，取２　ｌ作为模板进行ＰＣＲ，有四个克隆扩增　出ＨＰＶ１８Ｅ６片段，阳性的菌液加入氨苄霉素抗性的　ＬＢ液体培养基中震荡摇菌，３７℃过夜。参照Ａｘｙｇｅｎ　质粒小量提取试剂盒操作规程提取纯化ｐ３×ｆｌａｇ－　ｍｙｃ．ＣＭＶ．２４．ＨＰＶ１８Ｅ６，Ｈｉｎｄｍ、Ｓａｌ　Ｉ酶切质粒，电泳　５　０００　４　０００　２　０００　１　５００　鉴定，鉴定证实后的细菌扩增培养，提取质粒，送到　上海生工生物工程有限公司测序鉴定。　１．２．２重组质粒转染Ｈｅｌａ细胞将人子宫颈癌细　１　０００　５０Ｏ　１帅０　７５０　５Ｏ０　２５０　１００　胞株Ｈｅｌａ￣到６孔板中，每孔２×ｌＯｓ，完全培养基　培养２４　ｈ后用ＤＭＥＭ洗涤２次，分别将ｐ３×ｆｌｇ．ａ　ｍｙｃ．ＣＭＶ．２４．ＨＰＶ１８Ｅ６质粒、ｐ３×ｆｌａｇ．ｍｙｃ．ＣＭＶ一２４　１：ｗｉｄｅ　ｒａｎｇｅＤＮＡｍａｒｋｅｒ（５００—１２０００）；２：Ｈｉｎｄ［Ｉ］、ＳａｌＩ双酶切产　物的电泳条带；３：目的基因片段电泳条带；４：ｒａ×ｆｌａｇ－ｍｙｃ—　ＣＭＶ．￣空质粒酶切后电泳条带；５：ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ（２ＯＯＯ）　对照质粒各４腭，脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００　１０　ｌ／孔。　转染６　ｈ后，更换完全培养基，４８　ｈ后收取细胞。‘　１．２．３蛋白的提取及Ｗｅｓｔｅｒｎ．ｂｌｏｔ检测收取转染　细胞，冷ＰＢＳ洗３次后，加入３０　ｌ　ＲＩＰＡ（临用前加入　ＰＭＳＦ、抑蛋白酶肽）冰上３０　ｍｉｎ，４￣Ｃ　１２　０００　ｒｐｍ离心　图２　Ｉ－ＩＰＶ１８Ｅ６目的基因片段电泳图及ｐ３×ｔｌａｇ－ｍｙｅ－　ＣＭＶ．２４．ＨＰＶ１８Ｅ６酶切鉴定　２．３　ｐ３×ｆｌａｇ－ｍｙｅ－ＣＭＶ－２４－ＨＰＶ１８Ｅ６重组质粒转　染Ｈｅｌａ细胞后，Ｅ６蛋白和ｆｌａｇ标签的表达情况　３０　ｍｉｎ，移上清至一新的微量离心管，蛋白定量后进　ｐ３×ｆｌａｇ－ｍｙｃ—ＣＭＶ　４．ＨＰＶ１８Ｅ６重组质粒转染Ｈｅｌ２ａ　中国实验诊断学２０１０年２月第ｌ４卷第２期　一１６１一　细胞４８　ｈ后，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测结果显示转染组Ｅ６　帮助分析靶蛋白的生物学功能，并且可以用专门的　蛋白显著升高并可检测到ｆｌａｇ标签（图３）。　单抗进行检测＿ｌｏ＿。为了进一步提高ｆｌｇａ标签的检　测能力，目前常用３×ｆｌｇａ标签系统，这一三联体ｆｌｇａ　Ｈｅｌａ　抗原表位是亲水性的，由２２个氨基酸组成，可以检　Ｃｏｎ　Ｅ６　测表达低至１０　ｆｍｏｌ水平的融合蛋白。而且研究发　现使用这些很小的肽标签不会对融合蛋白质的功能　Ｅ６　及定位发生干扰。此外，含ＣＭＶ启动子可以高效启　ＧＡＰＤＨ　动目的蛋白在细胞中的表达，进一步有助于目的蛋　白的检测。　图３　本实验中利用亲和标签ｆｌｇａ对目的蛋白进行检　３讨论　测和监测的方法，将已合成的ｐ３×ｆｌｇａ－ｍｙｃ－ＣＭＶ．２４一　目前，子宫颈癌发病率居高不下，且发病年龄趋　ＨＰＶ１８Ｅ６质粒导入子宫颈癌细胞株Ｈｅｌａ细胞中，并　于年轻化，宫颈癌发病与人乳头状瘤病毒（ＨＰｖ）感　对其蛋白复合物进行检测，不仅提高了Ｅ６蛋白的表　染密切相关，ＨＰＶ为双链环状ＤＮＡ，其片段长度约　达量，通过ｆｌｇａ标签系统使得Ｅ６蛋白更易于检测，　为８．０　ｋｂ，编码６个早期蛋白和２个晚期蛋白，ＨＰＶ　为进一步研究ＨＰＶ１８Ｅ６蛋白及其复合物的结构功　通过抑制一系列的靶蛋白，如肿瘤抑制因子，避免了　能及其在子宫颈癌中所发挥的作用奠定了基础。　，　被感染细胞的凋亡，从而使细胞处于永生化状　作者简介：卫莹（１９８４一），女，硕士在读，主要研究方向：妇科　态＿３、４Ｊ。其中Ｅ６、Ｅ７是ＨＰＶ致癌的关键分子，在宫　肿瘤，现就读于安徽医科大学附属省立医院。　颈癌组织中持续表达，能促使宿主细胞进入增殖周　参考文献：　期而导致细胞复制，在细胞恶性转化中起关键作用。　［１］ＺＵＲ　ＨＡＵＳＥＮ　Ｈ．Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍｓｅｓ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ：ｆｒｏｍ　ｂａｓｉｃ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｔｏ　ｃｌｉｎ－　ｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎ　ａｔ　Ｒｅｖ　Ｃａｎｃｅｒ，２００２，２：３４２．　ＨＰＶ　Ｅ６蛋白由１５１个氨基酸残基组成，含有２个锌　［２］Ｈ　１　ＡＨ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ　ＫＡ．ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｌｍｓ　ｔｙｐｅ　指结构，每个锌指结构含有２个Ｃ．Ｘ—Ｘ—Ｃ序列，锌指　ｌ８　Ｅ６　ａｎｄ　Ｅ７　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ＨｅＬａ　ｃｅｌｌｓ．Ｊ　ｖｊｒｏｌ，２００３，７７（１Ｏ）：　结构是Ｅ６发挥功能所必需的ｌ＿５　Ｊ。高危型ＨＰＶ　Ｅ６　６Ｏ６６．　与Ｅ７相互作用使人类的角质形成细胞永生化，并通　［３］Ｗｏｅｄｍａｎ　ＣＢ，Ｃｏｌｌｉｎｓ　ＳＩ，Ｙｏｕｎｇ　ＬＳ．Ｔｈｅ　ｎａｔｕｒａｌ　ｈｉｓｔｏｒｙ　ｏｆ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　Ｉ－ＩＰＶ　过作用于ｒａｓ致癌基因从而使细胞发生恶性转　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｕｎｒｅｓｏｌｖｅｄ　ｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｃａｎｃｅｒ，２Ｏ０７，７（１）：１１．　化ｌ６Ｊ。Ｅ６蛋白是ＨＰＶ感染过程中最早表达的蛋白　［４］Ｚｈａｎｇ　Ｙ，Ｄａｓｇｕｐｔａ　Ｊ－Ｍａ　ＲＺ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ａ　ＨＰＶ－Ｅ５　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｂｏｕｎｄ　ｔｏ　ＭＡＧＵＫ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ‘ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ　ｂｙ　之一，通过招募Ｅ６ＡＰ泛素酶形成复合体，然后与　ａ　ｈｉｈｇ—ｒｉｓｋ　ＨＰＶ　ｏｎｅｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ　ｖｊｍｌ，２００７，８１（７）：３６１８．　ｐ５３核心部分相结合，Ｅ６将活化的泛素转移到ｐ５３　［５］Ｌｉｐａｒｉ　Ｆ，ＭｃＧｉｂｂｏｎ　ＧＡ，Ｗａｒｄｒｏｐ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　蛋白，ｐ５３进行泛素化降解，使ｐ５３蛋白控制的Ｇ１／Ｓ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｄ　ｏｆ　ａｎ　Ｎ．ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｚｎ２　节点失去控制，导致细胞染色体不稳定和基因突变　＋一ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍｓ　ｔｙｐｅ　１６　Ｅ６　ｐｒｏｔｅｉｎ．　增加以及外源ＤＮＡ整合到染色体中机率大大升　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙｒ，２００１，４０（５）：１１９６．　［６￣Ｙｏｓｈｉｄａ　Ｓ，Ｋａｊｉｔａｎｉ　Ｎ，Ｓａｔｓｕｋａ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｒａｓ　ｍｏｄｉｉｆｅｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎ—　高ｌ＿７’８ｊ。此外，Ｅ６还可与细胞内许多蛋白相互作用　ｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍｓ　ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｊ　而协同参与细胞转化过程：如抑制宿主细胞凋亡、激　Ｖｉｒｏｌ，２００８，８２（１７）：８８２０．　活端粒酶等对宫颈癌细胞的恶性转化及细胞永生化　［７］Ｍａｓｓｉｉｍ　Ｐ，Ｓｈａｉ　Ａ，Ｌａｍｂｅｒｔ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．ＨＰＶ　Ｅ６　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆｐ５３　ａｎｄ　ＰＤＺ　过程有重要作用　９　Ｊ。但由于Ｅ６蛋白在子宫颈癌细　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ　ｉｎ　ａｎ　Ｅ６ＡＰ　ｎｕｌｌ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ．［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８，　胞株Ｈｅｌａ细胞中的表达水平太低，很难用Ｗｅｓｔｅｍ．　２７（１２）：１８００．　［８］ＦｉａｎｕｎａＭ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ　Ｂ．Ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍｓ　Ｅ５　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｃｏｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ等方法检测ｌ＿２Ｊ，阻碍了我们对其致癌机制的　ｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｔｏ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１，２０：７８７４．　进一步研究。　［９］Ｎｏｍｉｎｅ　Ｙ，Ｍａｓｓｏｎ　Ｍ，Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｍ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　随着组蛋白学的迅速发展，重组蛋白质的应用　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｅ６　０ｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　近年来大大增加，重组蛋白杂合体含有一个多肽融　Ｃｅｌｌ，２００６，２１（５）：６６５．　合担体也就是亲和标签可用于辅助目标蛋白的检　［１０］Ｎｏｎａｋａ　Ｈ，Ｆｕｊｉｓｈｉｍａ　ＳＨ，Ｕｅｈｉｎｏｍｉｙａ　ＳＨ，ｅｔ　ａ１．ＦＬＡＧ－ｔａｇ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｃｏ．　ｖａｌｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｖｉａ　ａ　ｂｉｎｄｉｎｇ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｙｌ—ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｏｒｇ　测。Ｆｌｇａ标签系统是利用一短的亲水８氨基酸肽并　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　Ｌｅｔｔ，２ＯＯ９．１９（２３）：６６９６．　’　融合到目标蛋白，常标记于重组蛋白质的氨基端以　（收稿日期：２００９—０８—０７）