酶解法制备脱植醇叶绿素工艺研究

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2024年5月16日发(作者：)

　湖南农业科学（

HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES

）

DOI:10.16498/.2018.006.021

2018，（6）：84-87

2018年6月　

 酶解法制备脱植醇叶绿素工艺研究 

 乔克威

1

，李帅夫

1

，余国梁

1

，周喜新

1,2

，杨　华

1

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学科技处，

湖南 长沙 410128）

摘　要：

通过单因素试验考察菠菜叶绿素酶酶解叶绿素的底物浓度、酶浓度、pH值、温度等因素，再通过正交试验获得最优的叶绿素酶解脱

植醇工艺条件。结果表明，在叶绿素底物浓度为1.6 mmol/L、叶绿素酶浓度为50%原酶浓度、pH值为7.0、酶解温度为35℃时有最大酶解速率。

关键词：

叶绿素；叶绿素酶；酶解速率

中图分类号：Q71　　　　　　文献标识码：A　　　　　　文章编号：1006-060X（2018）06-0084-04

 Process Optimization of Hydrolyzing Chlorophyll to Remove Phytol by Enzymatic Hydrolysis

QIAO Ke-wei

1

，

LI Shuai-fu

1

，

YU Guo-liang

1

，

ZHOU Xi-xin

1,2

，

YANG Hua

1

（

1. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. Science and Technology

Department, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC

）

Abstract

：

The substrate concentration, enzyme concentration, pH, temperature and other factors of chlorophyll hydrolysis were

investigated by single factor experiment. The optimum conditions of chlorophyll free enzyme and ethanol fermentation were obtained by

orthogonal experiment. And then make sure the optimum conditions of chlorophyll free enzyme and ethanol fermentation were obtained by

orthogonal experiment. The results showed that the maximum enzymolysis rate could be obtained when the concentration of chlorophyll

substrate was 1.6 mmol/L, the concentration of chlorophyll enzyme was 50%, the pH was 7, and the enzymolysis temperature was 35

℃

.

Key words

：

chlorophyll; chlorophylase; enzymatic hydrolysis rate

叶绿素是一类植物色素，其主要作用是参与光

合作用，是该过程中的一类主要作用基质。光合作用

作用于植物细胞叶绿体中，是植物通过合成含有化合

能的有机化合物从而固定光能的过程

[1]

。叶绿素分布

范围广泛，在所有以光合作用获取能量的自养生物体

内都有存在，包括绿色植物、原核的蓝绿藻（蓝菌）

和真核的藻类。诺贝尔奖获得者Richard Willstatter和

Hans Fisher研究发现：人体内血红蛋白分子与叶绿素

的分子结构较为相似

[2]

。但由于叶绿素存在叶绿醇（植

醇）侧链，水溶性不如血红素。如果将叶绿素进行改性，

酶解脱去植醇，将镁原子置换成亚铁离子，叶绿素的

结构与性质更类似血红素，补血效果应该更加明显。

在植物衰老和储藏过程中，能产生叶绿素酶

[3]

。叶绿

素酶作用底物为叶绿素，通过与叶绿素上特定结合位

点结合，催化叶绿素中植醇酯键水解，从而产生脱植

醇叶绿素，利用该酶可以达到脱植醇目的。由于H

+

易于进入叶绿体与叶绿素结合，置换叶绿素中镁离子，

用含有大量H

+

的酸性物质处理叶绿素，从而获得去

收稿日期：2018-04-26

基金项目：湖南省科技计划项目（2014NK3064）

作者简介：乔克威（1993-），男，河北保定市人，硕士研究生，研

究方向：分子生物学。

通讯作者：周喜新

镁叶绿素。去镁叶绿素再与亚铁离子结合，形成铁代

叶绿素

[4-5]

。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1　供试材料　叶绿素购自郑州超凡化工有限公

司。新鲜菠菜从湖南农业大学农贸市场购买。

1.1.2　主要试剂　丙酮，1,4-二氧六环，磷酸氢二钠，

磷酸二氢钠，正己烷，Triton X-100。

1.1.3　主要器材　电子分析天平，上海卓精电子科技

有限公司；752N紫外可见分光光度计，上海仪电分

析仪器有限公司；HH-501S超级恒温水浴锅，上海赫

田科技用品有限公司；H1650R高速冷冻离心机，湖

南湘仪离心机仪器有限公司；JY-6.0 pH计，广州佳仪

精密仪器有限公司。

1.2　试验方法

1.2.1　菠菜叶叶绿素酶的提取　称取适量新鲜无虫

蛀、无农药残留、无虫卵菠菜叶，清洗干净室温下晾

干，剪碎研磨致叶片呈糊状，加入已4℃预冷24 h的

丙酮，混合成匀浆，抽滤，对滤渣用4℃丙酮多次冲

洗，直至滤渣呈无色。将滤渣在室温环境通风橱中风

干获得丙酮粉，将丙酮粉置于4℃环境下保存。取2

•

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乔克威 等：酶解法制备脱植醇叶绿素工艺研究

g前实验获取的丙酮粉，加入pH值 7.0的20 mmol/L

磷酸缓冲液50 mL，0℃冰浴30 min，在磁力搅拌器

上中速搅拌5 min。取丙酮溶液于低温冷冻离心机中，

在4℃、8 000×g条件下离心20 min，用移液枪吸取

上层清液进行酶活性的测定

[6]

。

1.2.2　菠菜叶叶绿素酶活性的测定　构建缓冲液体

系：180

μ

L 20 mmol/L含0.24% Triton X-100磷酸缓冲

液，调节pH值至7.0。该体系在35℃水浴锅中加热，

加入20

μ

L 1.0 mmol/L的叶绿素溶液、20

μ

L酶液。设

置20

μ

L酶液和200

μ

L磷酸缓冲液的对照组。在两

组水浴反应30 min后加入660

μ

L丙酮正己烷反应终

止剂，丙酮正己烷体积比为2∶3。对两反应组进行

低温离心，以8 000×g速度离心10 min，取下层清液

加入2.4 mL磷酸缓冲液和丙酮1∶1配置的稀释液，

摇匀，通过分光光度计测定该体系在663 nm、645 nm

吸光值。酶活定义：1

μ

mol叶绿素a在1 min水解所

需的酶量为一个酶活单位（U），每mg蛋白所含有的

酶活性为比活，即U/mg。

1.2.3　酶液酶学性质研究　（1）最适底物浓度的确定。

设定叶绿素底物浓度分别为0.8、1.2、1.6、2.0 mmol/L，

各20

μ

L，加入20

μ

L酶液，缓冲液180

μ

L，在35℃

条件下水浴30 min测定条件如前，比较酶活力大小。

（2）最适酶浓度的测定。取20

μ

L酶液，分别加蒸馏

水稀释浓度为原来的10%、20%、30%、40%、50%、

60%、70%、80%、90%、100%。各取20

μ

L稀释后

的酶液，测定条件如前，比较酶活力大小。（3）最适

反应温度的测定。取2.5 mL单位的EP管编号，加

入由上述试验所测得浓度的叶绿素20

μ

L，最适浓度

粗酶20

μ

L，加入180

μ

L磷酸氢钠-磷酸氢二钠缓冲

液，分别置于30、35、40、45℃的水浴条件下反应，

水浴30 min取出，测定酶活力

[7]

。（4）最适反应pH

值的确定。对照工具书分别称量磷酸氢钠和磷酸氢二

钠，按比例混合调制成pH值为6.5、7.0、7.5、8.0的

磷酸缓冲液，用pH计测量并检验缓冲液体系pH值。

取20

μ

L酶液和20

μ

L最适浓度的底物，分别加入

180

μ

L不同pH值磷酸缓冲液，在35℃条件下反应30

min，测定酶活力，确定最佳缓冲液pH值。

1.2.4　正交实验验证　在单因素试验的基础上，选择

对叶绿素酶酶解条件影响的4个因素进行L

9

（3

4

）正

交优化。正交试验因素水平设计表见表1。

表1　L

9

（3

4

）正交试验因素水平设计

因 素

水 平

1

2

3

A叶绿素浓度

（mmol/L）

1.2

1.6

2.0

B叶绿素浓度

（%）

40

50

60

C反应温度

（℃）

30

35

40

D反应

pH值

6.5

7.0

7.5

2　结果与分析

2.1　叶绿素底物浓度对叶绿素酶活力的影响

叶绿素酶解脱速率与叶绿素底物浓度有关。在底

物叶绿素浓度较低时，底物未与叶绿素酶完全结合，

此时酶反应速率受底物浓度制约，酶未发挥最大效力，

随着底物浓度的提高，反应速率提高，此时反应速率

与叶绿素浓度的关系呈正比关系。当叶绿素浓度达到

一定时，反应速率上升速率减弱，基本保持不变，此

时叶绿素浓度为该酶酶促反应最大时叶绿素浓度。因

此，叶绿素酶催化叶绿素降解的反应符合酶促反应的

动力学特征

[8]

。

由图1可知，底物浓度为1.6 mmol/L左右时叶

绿素酶解脱速率达到最高值，由此可以看出最适宜叶

绿素酶解脱底物浓度为1.6 mmol/L。在叶绿素浓度较

低时，叶绿素酶未充分与底物结合，未发挥最大效益；

当叶绿素浓度较高时，叶绿素酶达到过饱和状态，此

时制约酶促反应的因素是底物含量较少。

0.004 5

0.004 0

0.003 5

酶

活

（

U

）

0.003 0

0.002 5

0.002 0

0.001 5

0.001 0

0.000 5

0

0.81.21.62

叶绿素浓度（mmol/L）

图1　叶绿素浓度对叶绿素酶活性的影响

2.2　叶绿素酶浓度对解脱速率的影响

酶催化反应速率与叶绿素酶浓度有关。在叶绿素

酶酶液浓度较低时，底物叶绿素处于富余状态，没有

足够的底物与酶结合，此时酶促反应速率与会随着叶

绿素酶浓度的增加而提高，与酶浓度呈正比关系；但

随着叶绿素酶浓度的增加，当叶绿素酶浓度达到一定

比例时，叶绿素酶与底物充分结合，反应速率的增加

不再遵循正比关系，反而基本保持不变。

由图2可知，当叶绿素酶浓度为原酶液浓度的

50%时达到了最大酶促反应速率。在叶绿素酶浓度较

低时，叶绿素酶含量较少无法对底物完全反应，达不

到最大反应速率；在叶绿素浓度较高时，叶绿素酶已

经达到了饱和状态，此时再增加底物浓度是浪费酶液。

2.3　不同pH值对解脱速率的影响

酶的活力受环境pH值的影响，不同酶所对应的

最适pH值不同。在特定的pH值下，酶可以表现出

最大活力，在高于或低于该pH值环境下，外界因素

会降低该酶活力。通过文献了解到，酶对底物的作用

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检测分析

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　湖南农业科学（

HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES

）

0.003 5

0.003 0

酶

活

（

U

）

酶

活

（

U

）

2018年6月

0.003 0

0.002 5

0.002 0

0.001 5

0.001 0

0.000 5

0.002 5

0.002 0

0.001 5

0.001 0

0.000 5

0

108090100

0

30

叶绿素酶浓度（%）

3540

反应温度（℃）

45

图2　叶绿素酶浓度对反应速率的影响

图4　温度对叶绿素酶活性的影响

机制主要为酶通过与底物上的特殊结合位点结合，降

低反应活化能，使结合体达到易分离状态，进而使底

物分解。改变pH值会影响酶分子的空间构象，进而

降低酶促反应速率。

如图3所示，在pH值为7.0时，达到了该酶促

反应的最适宜条件。当环境pH值低于或是高于7.0时，

酸碱度的变化影响了叶绿素酶的活性，使该酶的催化

活力下降。因此，可以基本确定在pH值为7.0时酶

反应速率达到最大。

0.003 8

0.003 6

0.003 4

酶

活

（

U

）

2可知，对脱植醇的影响顺序为：A>D>B>C，即叶绿

素浓度>反应pH值>叶绿素酶浓度>反应温度，最

优组合为A

2

B

2

C

3

D

1

，即叶绿素浓度1.6 mmol/L、叶绿

素酶浓度为50%、反应温度40℃、反应pH值为6.5，

叶绿素酶活力最大。

表2　正交试验结果

实验号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

K

1

K

2

因 素

A

1

1

1

2

2

2

3

3

3

0.009 29

0.010 90

0.008 29

0.002 61

B

1

2

3

1

2

3

1

2

3

0.009 29

0.010 88

0.008 62

0.002 24

C

1

2

3

2

3

1

3

1

2

0.009 44

0.008 63

0.009 60

0.000 97

D

1

2

3

3

1

2

2

3

1

0.008 11

0.010 51

0.009 20

0.002 40

酶活力

（U）

0.002 77

0.003 88

0.002 64

0.003 45

0.003 89

0.003 56

0.003 07

0.003 11

0.002 11

0.003 2

0.003 0

0.002 8

0.002 6

0.002 4

0.002 2

0.002 0

6.57

缓冲液pH值

7.58

K

3

R

图3　不同pH值下的叶绿素酶活性

2.4　最适反应温度的确定

酶催化反应速率与温度有关，温度的改变会影响

酶活性的强弱。由图4可知，在低温条件下，温度的

升高会提高酶的活性，在35℃时，酶促反应速率达

到最大。但环境温度达到35℃以上时，随着温度的升

高，叶绿素酶活力会逐渐降低。由于大部分酶由蛋白

质构成，蛋白质在高温环境下会失活，从而影响蛋白

质性状的表达。根据该实验结果，可以推测由于温度

的升高，酶蛋白逐渐失活，对叶绿素催化作用减弱，

导致酶反应速率下降。不同植物、不同部位、不同时

期的酶的活力不同，受温度影响也不同，最适酶促反

应温度也不尽相同，但大部分植物的最适反应温度在

20~50℃之间。

由于正交试验结果与单因素试验结果不同，改变

试验反应条件，进行二次试验验证。取20

μ

L 50%浓

度粗酶和20

μ

L 1.6 mmol/L浓度的底物加入到180

μ

L

pH值7.0的缓冲体系中，在35℃下反应，测定酶活。

经测定，在上述条件下，酶活力为0.004 27 U。大于

在叶绿素浓度1.6 mmol/L、叶绿素酶浓度为50%、反

应温度40℃、反应pH值6.5条件下的酶活力。综上，

最适反应条件为叶绿素浓度1.6 mmol/L、叶绿素酶浓

度为50%、反应温度35℃、反应pH值为7.0。

经由酶活力计算公式，计算可得，在上述最优条

件下，酶活力为0.004 27 U。

3　结论与讨论

研究表明，最优的叶绿素酶解脱植醇工艺条件为：

叶绿素浓度1.6 mmol/L、叶绿素酶浓度为50%、反应

温度35℃、反应pH值为7.0。

2.5　正交试验确定最适宜方案

对叶绿素浓度、叶绿素酶浓度、反应温度、反

应pH值4个因素选择3个水平进行正交试验。由表

•

检测分析

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乔克威 等：酶解法制备脱植醇叶绿素工艺研究

研究发现，叶绿素底物浓度的提高对解脱反应速

率的提高有一定促进作用，但底物浓度达到一定程度

时，酶液已经基本饱和，酶利用率达到最大，此时增

加底物浓度对于提高解脱反应速率提高效果甚微。经

过文献阅读了解到，米氏常数K

m

值是反应酶动力学

的重要特征性常数，对于了解该反应途径的酶活力最

适底物浓度具有重要意义。但不同浓度系列的底物浓

度对于K

m

值的测定有一定影响，在测定一种酶的K

m

值时仅选用了高浓度范围，则无法观测因多酶造成的

结果偏离。试验注重解脱反应的最大反应速率，米氏

常数为反应速率达到最大反应速率一半时的数值，依

据对米氏常数的利用可以进一步增大反应速率

[9]

。

解脱速率与叶绿素酶浓度也有关，在底物浓度远

大于酶浓度时，酶浓度的增加速率与酶促反应的解脱

速率呈正比关系，但这种情况建立在有纯酶液或含酶

量极高的组织提取液，通过对新鲜叶片的研磨提取无

法达到较高酶量。在底物浓度固定的情况下，通过找

寻最适宜酶浓度，在工业上可以降低成本，在实验室

实验中可以降低实验操作复杂程度，提高实验准确性。

经过观察发现，在叶绿素酶浓度达到50%时，酶促

反应达到最大反应速率值，底物和酶已经完全饱和，

此时提高酶浓度对于提高酶活作用较小且浪费物料。

酶反应介质的pH值会影响酶反应速率的提高，

这一影响主要作用在底物活性中心上的必需基团的解

离程度和催化基团中质子供体或质子受体所需的离子

化状态，同时，pH值也会影响底物和辅酶的解离程

度，在此基础上影响底物和酶的结合，导致酶解速率

降低。在pH值适宜的情况下，酶、辅酶和底物达到

特定的解离状态才能使他们相互结合，进而达到酶解

反应的最大值，此时的环境pH值称为该酶的最适pH

值。在植物中，一般酶最适pH值在7.0左右，部分

耐碱性植物中酶耐受pH值可以达到9。酶最适pH值

是一种特定环境下的该酶活力最大的pH值，并非一

成不变，而是受底物浓度、缓冲液的种类和浓度以及

酶的纯度、酶液中杂质的种类等多方面的影响

[10]

。

酶活力也受温度的影响，不同种类酶适宜温度不

同，在低温条件下，温度每升高10℃，酶的活力会提

高1~2倍，但当温度较高时，高温会使酶蛋白失活，

从而导致酶促反应速率急剧下降。值得注意的是，高

温并不能使酶蛋白迅速失活，而是逐渐变性，在此基

础上，酶在变性过程中会进行一部分酶促反应，从而

影响实验结果。低温不会导致酶变性，低温会抑制酶

的活性，但温度升高时酶会逐渐恢复活性。温度不是

酶的特征常数，酶促反应的最适宜温度会随着pH值、

底物浓度、酶的浓度以及辅酶浓度和性质的改变而发

生改变。最适温度的确定需要多种条件的共同确定。

参考文献：

[1]　甘志军，王晓云. 叶绿素酶的研究进展[J]. 生命科学研究. 2002，

22（4）：373-374.

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研究进展[J]. 植物学通报，1998，（增刊）：41-46.

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[6] 周凤丽. 银杏叶绿素降解酶的诱导表达研究[D]. 无锡：江南大学，

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关基因的表达分析[J]. 园艺学报，2015，42（7）：1338-1346.

[8] 付天齐，王向伟，胡江华，等. 叶绿素及其Cu、Zn衍生物的伪装

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阳医学院学报，1994，（3）：239-242.

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叶绿素的研究[J]. 食品工业科技，2014，35（5）：172-177.

（责任编辑：夏亚男）

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本文标签： 反应浓度底物速率试验