质粒编码的超广谱β-内酰胺酶CTX-M-55及碳青霉烯酶NDM-1和IMP-1的

2024-07-29 作者:

质粒编码的超广谱β-内酰胺酶CTX-M-55及碳青霉烯酶NDM-1

和IMP-1的分子遗传特征研究

研究目的：鉴定质粒介导的临床分离多药耐药（MDR）菌株的β-内酰胺酶类型，明确酶的编码基因、基因座位以及可移动元件导致细菌耐药性增强的遗传进化作用，从而追溯超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和碳青霉烯酶耐药基因的来源，阐明质粒编码的肠杆菌科细菌和非发酵菌获得性耐药的分子遗传特征。研究方法：对临床收集的MDR肠杆菌科细菌和非发酵菌进行细菌耐药谱分析和产酶初筛，选定青霉素类和头孢菌素类耐药#1081（来自浙江省痢疾患者粪便标本）、碳青霉烯类耐药3-SP（来自陕西省肺炎患者痰标本）和碳青霉烯类、呋喃类及氨基糖苷类均耐药的A22732（来自北京市肺炎患者痰标本）为研究对象。

通过生化、质谱和16sRNA基因鉴定菌种；测定菌株MIC值，利用双纸片协同法、改良Carba NP法、PCR技术鉴定β内酰胺酶类型和耐药基因分型；通过接合转移试验判断耐药基因是否通过质粒传递，比较含有不同β-内酰胺酶基因接合子的耐药谱；采用DNA测序技术分析耐药基因座位及其上下游序列，通过引物延伸实验确定转录起始点，推断耐药基因启动子；最终在NCBI数据库中比对耐药质粒的同源性，追溯耐药基因来源，分析整合子、转座子等可移动元件对细菌获得性耐药的遗传进化作用，明确菌株耐药的分子遗传特征。研究结果：经鉴定菌株#1081、3-SP和A22732菌株分别为宋内志贺菌（）、产气肠杆菌（nes）和木糖氧化无色杆菌（A. xylosoxidans）；其中宋内志贺菌#1081产ESBLs，携带blaCTX-M-55基因，产气肠杆菌3-SP和木糖氧化无色杆菌A227323产碳青霉烯酶金属酶（MBLs），3-SP携带blaNDM-1基因，A227323携带blaIMP-1基因，且基因均位于可接合性质粒上。

宋内志贺菌#1081的耐药性完全由携带唯一耐药基因blaCTX-M-55的可接合性质粒p1081-CTXM介导，其中插入序列ISEcp1是获得ESBLs blaCTX-M-55基因的转座元件。p1081-CTXM同源于狗粪便质粒，提示该耐药质粒在宠物非致病性大肠杆菌与人类致病性宋内志贺菌之间形成了的跨物种传播。

产气肠杆菌3-SP接合子全部获得3-SP的碳青霉烯类抗生素耐药表型，甚至对单酰胺类抗生素耐药，揭示出可接合性质粒p3SP-NDM携带的NDM-1耐药基因具有超强β-内酰胺酶活性。p3SP-NDM携带多个耐药基因和多个插入序列，其中两个插入序列ISAba125构成的转座子是blaNDM-1的转座元件。

该质粒同源于北京鲁氏不动杆菌的质粒pNDM-BJ01，说明携带NDM-1的pNDM-BJ01质粒已在中国的肠杆菌科和非发酵菌中形成跨地区跨种属的水平传播。木糖氧化无色杆菌A22732接合子部分获得A22732的碳青霉烯类药物抗性表型，说明除了产IMP-1酶外还有其他耐药机制参与野生株的碳青霉烯耐药。

我们首次发现A22732的可接合性质粒pA22732-IMP存在一种新型1类整合子，该整合子捕获基因盒aacA7-blaIMP-1并为之提供启动子Pc。通过比对与之同源的质粒序列pAKD31（挪威耕地）、pDB1（韩国土壤）和pB8（俄罗斯污水），发现捕获耐药基因的整合子在pAKD31和pDB1的基因重组热点区域发生了基因重组事件，导致了耐药质粒pA22732-IMP和pB8的产生。

研究结论：可接合性质粒、转座子和整合子等可移动元件（MGEs）介导β-内酰胺酶编码基因的水平转移（horizontal gene transfer,HGT），导致细菌耐药的跨物种、跨种属和跨地区传播；基因blaCTX-M-55、blaIMP-1和blaNDM-1编码的β-内酰胺酶耐药谱呈现递增趋势，揭示出在渐强的外在抗生素选择压力下细菌表现出超强的遗传进化能力；明确了产ESBLs和碳青霉烯酶临床分离MDR

肠杆菌科和非发酵菌耐药的分子遗传特征，依据基因来源将细菌耐药问题提升至环境基因组学范畴，揭示了土壤、动物和人类健康的不可分割性。