木质素合成关键酶——肉桂醇脱氢酶的研究进展

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2023年12月26日发(作者：)

木质素合成关键酶——肉桂醇脱氢酶的研究进展

龚琰;许梦秋

【摘 要】肉桂醇脱氢酶 (CAD)是木质素合成途径的关键酶之一,它作用于木质素单体生物合成的最后一步.重点综述了肉桂醇脱氢酶(CAD)的在基因家族方面,基因调控方面以及蛋白结晶方面的研究进展,讨论了存在的问题并提出了相关策略.

【期刊名称】《生物技术通报》

【年(卷),期】2010(000)004

【总页数】3页(P47-49)

【关键词】木质素;肉桂醇脱氢酶(CAD);调控

【作 者】龚琰;许梦秋

【作者单位】北京林业大学生物科学与技术学院,北京,100083;北京林业大学生物科学与技术学院,北京,100083

【正文语种】中 文

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD,EC 1.1.1.195)是木质素合成途径中第一个被研究的酶[1,2]。它是木质素合成过程中关键酶之一,催化多种不同的肉桂醛(香豆醛,芥子醛,松柏醛等)生成木质素单体的前体物质。目前,已经有许多CAD cDNA从不同的植物中被克隆出来,到目前为止已在NCB I上注册的CAD的完整mRNA序列共187条,对CAD cDNA序列分析的结果说明,它们具有高度的同源性。

越来越多的试验证明CAD在植物体内存在着基因家族。研究者发现拟南芥中有9

个CAD基因[3,4]。它们的相似性高达70%,其中的6个能催化5种肉桂醛生成肉桂醇,另外3个催化能力很低且只有在底物浓度很高的时候才表现活性。有力地说明了在拟南芥中木质素单体的合成不是靠单一CAD催化生成的。AtCAD5和AtCAD4被证明催化活性和同源性最高,因而在木质素生物合成中起着重要的作用[5]。AtCAD5能有效催化所有5种底物,而AtCAD4却几乎不能催化芥子醛。

Fan和Shi[6]研究表明,棉花纤维中含有8个CAD基因。其中GhCAD1和GhCAD6的同源性最高。在棉花纤维次生木质部形成时,只有GhCAD6的表达量升高。系统进化分析表明GhCAD6属于第一类,它在木质素合成过程中起着主要作用。Gh-CAD1属于第三类,它被认为是对木质素合成有补偿性作用的机制。氨基酸序列分析表明棉花纤维中CAD的辅酶结合位点与bona fide的CAD的结合位点有很高的相似性。Tobias和Chowk[7]最近研究发现水稻中含有12个CAD基因。水稻染色体上9个不同位点包括12个基因编码产物截然不同的CAD,其中4个与木质化相关的基因在同一位点关系密切。

目前最新研究表明,杨树中含有15个CAD基因或类似基因[8]。系统进化分析表明CAD基因可被分为3类,一类存在于裸子植物和被子植物中,另外两类只存在于被子植物中。所有的杨树CAD同源基因,除了PtCAD4之外,都属于第一类和第三类。促进木质部生长的CAD基因(PtCAD4和Pt-CAD10)属于第一类和第二类。大多数杨树的CAD基因在各个组织,如树叶,茎,外表皮,木质部等都有表达,但表达水平不同。

Saballos等[9]报告在高粱中有14个CAD类似基因,它们分布于染色体的7个不同位点。与玉米和大米的CAD基因相比,高粱的CAD基因在基因的数量,排列和表达方式上都不同。高粱CAD2是主要参与木质化的系统发育的CAD基因,它的基因中包含有3个褐色叶中脉突变体的突变位点。Sattler和Saathoff等[10]报告高粱CAD4具有bm r6的表型,在木质素合成过程起主要作用。

研究者已经得到CAD活性降低的转基因烟草[11]、杨树[12]、苜蓿[12]、松柏[13]、玉米[14,15]和拟南芥[16,17]。研究表明几种转基因植物的CAD活性被抑制,木质素的总含量并未明显改变,但CAD的底物肉桂醛增加了,而产物肉桂醇减少。例如,Baucher等[12,18]将从杨树分离出来CAD的cDNA,进行正义和反义转化,结果表明木质部组织CAD活性下降70%,但木质素含量并未下降。光谱分析显示红色木质部的杨树香兰素和紫丁香基醛含量提高了。这些情况可能是由于抑制程度不足或存在其它同工酶的作用,其原因有待深入研究。

近几年有研究者[17]报道,将拟南芥的两个木质素合成相关的基因(AtCAD4和AtCAD5)双突变后,拟南芥与野生型对比出现倒俯茎,植株呈现俯倒状态。这是因为植株缺少维管组织,即大分子木质素含量大量减少。虽然突变植株中的酚醛的含量却与野生型中的含量一样。但在最后催化反应步骤上,突变体仅有很少的能力去生成木质素单体。而双突变的木本植物也表现出木质素大量减少的情况。

结晶一般分为3个不同阶段,分别为形成稳定的晶核,由晶核生成晶体,生长结束。单晶培养的方法[19]通常分为6种,包括溶液中晶体生长、界面扩散结晶、蒸汽扩散结晶、凝胶扩散结晶、水热法,溶液热法及升华法。蛋白结晶最常采用的是是蒸汽扩散法[20]。其原理是将蛋白质溶液溶解于含结晶剂的溶液中,悬滴或坐滴于封闭容器的上方,在容器底部的池液除不含大分子物质外其他物质与液滴相同。液滴和池液中的挥发性物质不断进行扩散,直到液滴的蒸汽压与池液的相等为止。在该过程中发生的体积变化使结晶剂的浓度升高,这很有可能导致过饱和及随后的结晶。

影响蛋白结晶的主要因素有结晶蛋白的纯度,过饱和度,温度,pH值,结晶剂,压力,外加物理场,及其他影响因素,如蛋白质结晶液的浓度,蛋白质的来源,细菌及真菌引起的污染程度,样品体积及氧化还原环境等。

研究者[21]已经在两个不同温度条件下得到拟南芥的AtCAD5的蛋白晶体和AtCAD5与NADP+结合产生的二元蛋白晶体。AtCAD5蛋白晶体分辨率为2.0A°。

AtCAD5与NADP+结合产生的二元蛋白晶体分辨率为2.6A°。通过对晶体结构的解析,CAD单体由两个结构域组成:一个是Ross mann折叠的核苷酸结合区域(残基163-301),另一个是底物结合区域(残基1-162,302-357)。活性中心就位于这两个区域中间的接合处。有Zn2+和NADP+等催化辅助物就结合在活性中心。

另有研究者[22]得到了颤杨SAD(催化底物为芥子醛的反应[23])的两个蛋白结晶(纯化过程中分别用DTT和βME处理的)。它们的分辨率分别为2.0A°和2.5A°。其中介绍了SAD的三维结构,通过对晶体结构的解析,揭示其活性中心与传统CAD蛋白活性中心的预测结构截然不同,分别从晶体结构和突变体活性检测结果中证明了SAD对底物芥子醛的高特异性。

通常情况下,在蛋白结晶试验中,不同的研究人员会用采用不同材料,甚至是相同的材料,所取得的试验结果也不一样。除了可能与试验材料及试验药品等相关,还可能是试验程序的设计和操作方面的问题。因此,需要科研人员加大试验力度。

经过国内外学者几十年的研究,现在部分植物CAD的基因家族成员已被阐明,极少的CAD蛋白质结构已被确定。随着分子生物学方法的快速发展及研究的不断深入,必将有更多的CAD基因家族成员和CAD蛋白结构被阐明。

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本文标签： 基因木质素结晶蛋白合成