一种叠氮噻吩类化合物作为抗结核分枝杆菌抑制剂的应用

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2024年4月23日发(作者：)

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(21)申请号 CN2.4

(22)申请日 2011.11.21

(71)申请人 华中农业大学

地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号

(72)发明人 何正国 曾菊梅 崔涛

(74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所

代理人 张红兵

(51)

C12Q1/18

C12R1/34

C12R1/32

(10)申请公布号 CN 103122369 A

(43)申请公布日 2013.05.29

权利要求说明书 说明书 幅图

(54)发明名称

一种叠氮噻吩类化合物作为抗结核

分枝杆菌抑制剂的应用

(57)摘要

本发明属于药物靶标技术领域，具

体涉及一种对结核分枝杆菌具有抑制作用

的小分子先导化合物的应用。该小分子化

合物即3-叠氮噻吩-2-羧酸，具有分子量

小，结构简单，渗透性好等优点，能有效

抑制结核分枝杆菌的生长，结核分枝杆菌

是结核病的致病菌，所以该小分子化合物

有治疗结核病的潜力，有望发展成为一种

抗结核新药。因此，本发明的小分子化合

物可以作为新的抗结核药物进行开发，为

治疗和治愈结核病提供了一种新的途径和

手段。本发明还涉及含有该小分子抑制剂

的制剂在制备抗结核药物中的应用。

法律状态

法律状态公告日

法律状态信息

2021-10-29

未缴年费专利权终止

2014-05-14

授权

2013-06-26

实质审查的生效

2013-05-29

公开

法律状态

未缴年费专利权终止

授权

实质审查的生效

公开

权 利 要 求 说 明 书

1.一种叠氮噻吩类化合物在筛选抗结核分枝杆菌药物化合物中作为抑制剂的应用，

其特 征在于，该化合物是3-叠氮噻吩-2-羧酸，其分子式为

构式如下所示； C5H3N3O2S；分子量为169.16，其结

其步骤如下：

(1)以耻垢分枝杆菌，牛结核分枝杆菌，结核分枝杆菌为参试菌；

(2)液体筛选培养基的制备：在100ml的液体筛选培养基中加入90ml 7H9液体培养

基和

(3)将步骤(1)所述的三种分枝杆菌分别接种于步骤(2)所述的液体筛选培养基中，于

37℃培养，其中：耻垢分枝杆菌培养3天，牛结核分枝杆菌和结核分

枝杆菌密度为1×10⁸～

10ml OADC营养液；

枝杆菌培养21天，至分

2×10⁸或光密度值OD₆₀₀为0.8～1，然后将每一种分枝杆

菌菌液稀释 并分装到96孔板中，稀释后的终浓度为1～

2×10⁴；

(4)将50μg/ml的3-叠氮噻吩-2-羧酸添加到步骤(3)的培养有分枝杆菌菌液的96孔

板中，通过读取OD₆₀₀值并与对照比较，判断分枝杆菌

的生长是否受到了抑制；

(5)重复步骤(4)的方法，测定3-叠氮噻吩-2-羧酸对结核分枝杆菌，牛结核分枝杆菌

及耻垢分枝杆菌的最低抑菌浓度(MIC)；

其中：

步骤(2)所述的OADC营养液组分及配比如下：5％牛血清白蛋白，0.2％葡萄糖，

0.06％

步骤(5)所述的最低抑菌浓度分别如下所述：

结核分枝杆菌 0.5μg/ml

牛结核分枝杆菌 1μg/ml。

油酸甘油酯，140mmol/l NaCl；

说 明 书

技术领域

本发明属于抑菌药物的筛选技术领域。具体涉及一种特异抑制结核分枝杆菌生长的

小分

背景技术

结核分枝杆菌是一种严重危害人类健康的病原菌，结核分枝杆菌在感染人体后，会

在人 体内存在数月或数年。据世界卫生组织统计，全世界每年大约有三百

全球约有三分之一的人口感染处于潜伏状态的结

疗法有一线和二线药物的混

的复杂

子化合物即叠氮噻吩类化合物作为抗结核分枝杆菌抑制剂的应用。

万人死于结核病，并且

核分枝杆菌(WHO，2009)。目前，结核病化学

合剂构成。实际的结核病治疗需要4-5种药物超过6-9个月时间

而又长期的治疗方案来根除该疾病，导致了严重的毒性和抗药性。事实上，由于具

有 不寻常的细胞壁，分枝杆菌天然地对大多数常用抗生素具有抗性。此

获得抗药性。由于结核分枝杆菌菌株对越来越多

(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)

共健康的威胁

外，遗传学改变也使其

的用于治疗多重抗药性结核病

的二线药物产生抗性，因此其已成为世界范围公

(Gandhi et al，2010)。对于MDR的结核分枝杆菌来说80％死亡率导致该疾病成

为严重的全球性健康问题。近年来出现的药物抗性菌株以及与HIV的共感

形式更加严峻。结核病不仅是存在于发展中国家的问题。

病成为了一个严重威胁全世界的疾

断工具已经迫

染问题，使得这一

随着全球旅行和移民的增加，结核

病。因此，寻找新的药物靶标并研发新的抗结核药物和诊

在眉睫(Ginsberg and Spigelman，2007)。特别地，我们需要具有新作用机制的对

发明内容

抗药性菌株具有活性的新药物。

本发明的目的在于叠氮噻吩类化合物作为抗结核分枝杆菌抑制剂的应用，所述的化

合物

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过筛选得到一种叠氮噻吩类化合物，该化合物具有如下所述的结构：

该叠氮噻吩类化合物是一种已知化合物，其中文名称为3-叠氮噻吩-2-羧酸；其英

文名 称为3-azidothiophene-2-carboxylic acid。其ZINC数据库ID为

分子量

具有抑制结核分枝杆菌生长并最终杀死结核分枝杆菌的特性。

8383235；分子式为C5H3N3O2S；

为169.16。为了叙述方便，在本说明书中简称该化合物为23#化合物或抑制剂23#。

该 化合物可以从商业途径购买得到，本发明所使用的该化合物是从荷兰

)购买得到。 Specs公司(网址：

本发明测定了该叠氮噻吩类化合物对结核分枝杆菌的抑制作用，在本发明的实施例

中，申 请人详细描述了所涉及到的若干参试的分枝杆菌，例如：耻垢

菌株的公众获得来源：中国医学细菌保藏

/，)，牛型

学细菌保藏管

分枝杆菌菌株(耻垢分枝杆菌

管理中心，菌种编号为：93202。网址：

分枝杆菌菌株(牛型分枝杆菌菌株的公众获得来源：中国医

理中心，菌种编号为：93006。网址：/)，结核分枝杆

菌菌株(结核分枝杆菌菌株的公众获得来源：中国医学细菌保藏管理中心，

网址：/)。本发明中将

养物中，然后将添加了上述

并与对

菌种编号为：93004。

50μg/ml的候选抑制剂添加到分枝杆菌的培

候选抑制剂的分枝杆菌于37℃培养7～8天，通过读取各OD值

照进行比较来判断分枝杆菌的生长是否受到了抑制。对照1为抑制剂23#的处理组，

对照2是使用抗结核的一线药物即利福平(RFP)处理组。实验过程中

组比较来评价利用候选抑制剂得到的抑制效果，

法还测定了3-叠氮噻吩-2-

浓度。

的数据是与两个对照

寻找具有抑制效果的化合物。采用同样的方

羧酸对结核分枝杆菌，牛型分枝杆菌及耻垢分枝杆菌的最低抑菌

本发明的优点如下

1、本发明获得的小分子化合物分子量小，结构相对简单，易溶于多种溶剂。

2、本发明获得的小分子化合物特异性好，能有效杀死结核分枝杆菌，而对同源菌

属耻垢分

3、本发明获得的小分子化合物抑制结核分枝杆菌的效果可以接近一线抗结核药物

利福平。

附图说明

图1.候选抑制剂23#对各分枝杆菌菌株的抑菌结果。

图2.固体斜面上观察各处理样品的存活情况，从左到右依次是不添加抑制剂23#的

对照组，

图3.最小抑菌浓度测定实验中结核分枝杆菌菌株在各抑制剂浓度下的生长情况。从

左到右叠 氮噻吩类化合物即抑制剂23#的浓度分别为：0.031，0.062，

4.00，8.00，16.00，32.00μg/ml。

添加抑制剂23#的处理组，添加利福平的对照组。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

枝杆菌效果不明显。

0.125，0.25，0.50，1.00，2.00，

具体实施方式

实施例1菌株的培养和液体抑制剂的配制

供试菌株的准备：

本实施例的参试菌株涉及耻垢分枝杆菌菌株(菌株编号：93202；从中国医学细菌保

藏管 理中心获得，网址：/，(下同))，牛型分枝杆

从中国医学细菌保藏管理中心获得)，结核分枝

菌保藏管理中心获得)。

菌菌株(菌株编号：93006，

杆菌菌株(菌株编号：93004，从中国医学细

筛选培养基的组分及制备：

液体筛选培养基的组分及其配制方法：在100ml的液体筛选培养基中加入90ml商

购的 7H9液体培养基(该7H9液体培养基购自美国BD公司，货号：

养液(5％牛血清白蛋白，0.2％葡萄糖，0.06％油

营养液购自美国BD公司，

养基。

271310)和10ml OADC营

酸甘油酯，230mmol/l NaCl，该商品OADC

货号：211886)，该液体培养基是针对分枝杆菌菌株的典型液体培

固体筛选培养基的组分及其配制方法：在100ml的固体筛选培养基中加入90ml商

购的 7H10固体培养基(购自美国BD公司，货号：262710)和

0.2％葡萄糖，0.06％油酸甘油酯，

固体培养基是

10ml OADC(5％牛血清白蛋白，

230mmol/l NaCl，购自美国BD公司，货号：211886)，该

针对分枝杆菌菌株的典型固体培养基。

候选抑制剂的准备：

本实施例的抑制剂(3-叠氮噻吩-2-羧酸)以溶液或混悬液使用。采用二甲基亚砜

(DMSO) 溶解抑制剂粉剂以便于后续实验使用。具体配制方法：先配制

的抑制剂浓缩液贮存备用，在测定抑制剂

杆菌及耻垢分枝杆菌

成原始浓度为50mg/ml(0.1M)

即3-叠氮噻吩-2-羧酸对结核分枝杆菌，牛型分枝

的最低抑菌浓度时，用上述配制好的抑制剂浓缩液进行浓度梯度实验，

其浓度梯度分别设计为：0.031，0.062，0.125，0.25，0.50，1.00，2.00，

32.00μg/ml。 4.00，8.00，16.00，

接种及培养方法：

将上述三种分枝杆菌分别接种于上述制备好的液体筛选培养基中，于37℃培养，

其中： 耻垢分枝杆菌菌株培养3天，牛型分枝杆菌菌株，结核分枝杆

菌密度为1×10⁸～菌菌株均培养21天，至分枝杆

2×10⁸或光密度值OD₆₀₀为0.8～1。然后将每一种分枝杆

菌菌液进行稀释 (终浓度为1～2×10⁴)并分装到96孔板中。

进行。 整个操作在常用的生物安全柜的无菌操作程序下

实施例2抑制剂的体外抑菌活性试验

按照实施例1的无菌操作程序，将实施例1的结核分枝杆菌菌液(菌种编号为：

93004) 接种到添加有抑制剂23#的筛选培养基中来确定抑制剂23#的体外抑

50μg/ml的抑制剂23#添加到结核分枝杆菌的细

OD值并与对照(含对照1和

1为不

菌活性。本实施例中将

菌培养物中于37℃培养7～8天，通过读取各

对照2)进行比较来判断结核分枝杆菌生长是否受到抑制。对照

添加抑制剂23#，对照2为添加利福平50μg/ml，实验过程中的数据是与两个对照

比较 来评价抑制剂23#对结核分枝杆菌抑制效

垢分枝杆菌菌株(菌果，牛型分枝杆菌菌株(菌种编号为：93006)，耻

种编号为：93202)的体外抑菌实验采用上述同样的方法，结果如图1所

示。从图1中可以明显看出候选抑制剂叠氮噻吩类化合物，即抑制剂23#能

枝杆菌和牛型分枝杆菌的生长，而对耻垢分枝杆菌不产

有效抑制结核分

生抑制效果。

实施例3确定叠氮噻吩类化合物的体外抑菌活性

将结核分枝杆菌(菌种编号为：93004)菌液接种到添加有叠氮噻吩类化合物的液体

筛选 培养基中来确定叠氮噻吩类化合物的体外抑菌活性。具体方法是：将

筛选得到的抑制剂23#添加到结核分枝杆菌的细

℃培养，经过8天的

50μg/ml的由实施例2

菌培养物中(菌液浓度为1～2×10⁷)于37

抑制剂23#处理后，将10μl结核分枝杆菌菌液涂到固体筛选培养基上于

37℃培养一个月，观察各样品的生长情况。结果表明：添加有抑制剂23#组

个样品均没有单菌落生长，而不用抑制剂23#的结核分

和利福平组的两

枝杆菌则生长良好，结果见图2。

实施例4确定候选抑制剂的最低抑制浓度(MIC)

在抗菌试验中，抑制的百分数的评价优选通过测定最低抑制浓度

(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)来进行。MIC定义为抗菌药物能抑

照实施例1的设计方案，将不同浓

0.062，0.125，

制培养基中细菌生长的最低浓度。按

度的抑制剂23#进行梯度稀释(其浓度梯度分别为：0.031，

0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，32.00μg/ml)，添加到培养有结

核分枝杆菌的液体筛选培养基中，37℃培养7～8天，通过读取各OD值来

生长是否受到抑制，结果见图3所示。耻垢分枝杆菌菌

条件同结核分枝杆菌，其MIC测

判断结核分枝杆菌

株，牛型分枝杆菌菌株的接种与培养

定结果如表1所示。

表1.抑制剂23#对各分枝杆菌属的最小抑菌浓度

参考文献：

Health Tuberculosis Control 2009：Epidemiology，

Strategy，

NR，Nunn P，Dheda K，Schaaf HS，Zignol M，van Soolingen D，

Jensen P，Bayona J. Multidrug-resistant and extensively drug-

ial ，2009.

resistant tuberculosis：a threat to global control of

rg AM，

Spigelman nges in tuberculosis drug research and

Med.2007 Mar；13(3)：290-4.

.2010 May 22；375(9728)：1830-43.

本文标签： 结核菌株噻吩叠氮化合物