生物化学知识点概述

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2024年6月19日发(作者：)

一名词解释

吸光度 是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度 与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等。吸光度用

A表示。A＝abc，其中a为吸光系数，单位L/(g·cm),b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ， c为溶液浓度，单位g/L

盐析 当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。

调整保留时间：气相色谱中,扣除死时间后的保留时间。t'R＝tR－t0

tR：进样开始至出某组分峰所需时间，称保留时间 t0：进样开始至出空气峰所需时间，称死时间

外标法 就是用标准品的峰面积或峰高与其对应的浓度做一条标准曲线,测出样品的峰面积或峰高,在标准曲线上查出其对应的浓度,这是最常用的一种定量方法

泳动度 指带电颗粒在单位电场强度中泳动的速度。也称迁移率。

单克隆抗体 免疫动物的脾细胞能产生相应的特异抗体，从中能选出单个细胞，经扩大培养，即可得到对应于一个抗原决定簇的单一抗体分子，即单克隆抗体。

序列标签位点 是在染色体上定位明确，且可用PCR扩增的单拷贝序列。

定向克隆：使外源DNA片段定向插入到载体分子中的方案叫定向克隆。

比较基因组学:在基因组图谱和序列分析的基础上，对已知基因组进行比较，了解基因的功能，表达机理和物种进化的学科。

摩尔吸光系数：是指在一定波长时，溶液浓度为1mol/L，厚度为1cm的吸光度，用ε或EM表示

分配系数 是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值

K=固定相中溶质的浓度/流动相中溶质的浓度

反离子 粘粒吸附决定电位离子层带电后，靠静电引力吸引溶液中电性相反的离子聚其周围，这部分离子称反离子，形成反离子层。

cDNA文库：将真核细胞内全部mRNA转录成cDNA并将双链cDNA（dscDNA）和载体连接，由此得到的cDNA克隆群体称为cDNA文库。

包含体：它是致密的不溶性蛋白和RNA的凝聚体，包含大部分的表达蛋白。

以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞质内聚集，形成包含体。

相对离心力：是指颗粒所受的离心力与地心引力（重力）之比。 即RCF=Fc/Fg

概述结构基因组学研究工作的基本步骤

① 绘制染色体的低分辨率遗传图谱和物理图谱， 遗传作图（genetic mapping）又称连锁图谱（linkage map），是通过测定重组率，确定用重组率表示的基因之间的相对位置。

物理图谱（physical map）是利用各种分子标记确定片段间的连接顺序，以及遗传标志之间用千碱基（kb）或兆碱基（Mb）表示的物理距离。

②重叠群的建立， 染色体被分解并完成测序后，需要组装，低分辨率物理图谱可以为组装提供标记。

制作低分辨率物理图谱，广泛使用序列标签位点（sequence tagged site, STS）。所谓的STS是在染色体上定位明确，且可用PCR扩增的单拷贝序列。

③高分别率物理图谱的制作，重叠群克隆中的大片段通常要被分解成较小的片段，用BAC进行亚克隆后，才可被用来通过随机切割进行测序。由于亚克隆中的片段也需要组

装，在分解大片段之前，需要制作大片段的高分辨率物理图谱。制作高分辨率物理图谱，可以采用多种不同的分子标记。（1）限制性片段长度多态性标记 （2）DNA重复

序列的多态性标记 （3）单核苷酸多态性标记

④序列测定 在制作高分别率物理图谱的基础上，就可以对BAC中插入的片段逐个进行测序。

⑤基因定位 基因定位的一个基本方法是重组分析，若某致病基因和某个分子标记如微卫星DNA的重组率超过5%，说明二者不连锁，若重组率接近于零，说明该基因位于标

记位点符近。

基因定位的另一个基本方法，是根据蛋白质结构的氨基酸序列，设计特异性的探针，通过分子杂交，筛选cDNA文库，这种方法称作功能克隆。

概述用分光光度法进行定量测定的常用方法和为减小测量误差应注意的问题

1. 吸光系数法（绝对法） 根据比尔定律A = εc l ，若 l 和吸光系数ε或E1%1cm已知，即可根据测得的A，求出被测物的浓度。 C = A / εl 通常ε和E1%1cm可以

在手册或文献中查到

2. 标准曲线法

（1）配置一系列浓度不同的标准溶液。 （2）在测定条件相同的情况下，分别测定其吸光度。 （3）以标准溶液浓度为横坐标（不必考虑显色剂等引起的体积和浓度变化），

以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C关系图。 （4）在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。

3. 对照法

在同样条件下配置标准溶液和样品溶液，在选定波长处，分别测量吸光度，根据定律 A标=EC标l A样=EC样l

在同种物质、同台仪器及同一波长测定的条件下l 和E 均为定值，所以：

减小测定误差的方法

1. 选择合适的显色剂，使显色反应的灵敏度高、选择性好、显色产物稳定。

2. 通过条件试验，找出最佳的试剂加入量、酸度、温度和显色时间。并使样品与标准品在尽可能完全相同的条件下进行测定。

3. 设置合适的对照。

4. 通过加掩蔽剂和控制pH值，消除共存离子的干扰。

5. 尽可能在吸光度0.11.0范围内测定，以减小吸光度误差。A < 0.1的溶液，尽量用摩尔吸光系数大的显色反应，在最大吸收波长处进行测定，吸收池厚度大一些，

溶液可通过萃取、浓缩、增大取样量来增加吸光度。A > 1.0的溶液，可通过稀释或用薄的吸收池来降低吸光度。

6. 减小仪器误差。用稳压器稳定电压以使入射光强度保持不变；吸收池厚度应一致，透光性好，不要用手摸透光面；吸收池与入射光线应垂直，否则会因光程增大而

发生误差。

比较用定时法，连续检测法和平衡法测定酶活力的优缺点

1 测定酶反应开始后某一时间内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度 的方法称为定时法 这种方法的优点是简单，因最后测定产物时酶反应

已被终止，故比色池无需保温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活力的影响。缺点是如果不用预试验确定，无法了 解酶作用的这段时间内是否都是零级反应，故很难保

证测定结果的真实性。

2 连续测定（每15s1min监测一次）酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法称为连续监测法

这种方法的优点是可将多点的测定结果（〔s〕或〔p〕的变化）连接成线，容易找到成直线的区段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活力，

不需要终止反应。缺点是因酶和底物边保温边测定的需要，仪器（比色计或分光光度计）必须有保温装置，而且产物（或底物）应是可被直接测定的化合物，且借以测定

的特殊性质，必须与底物（或产物）有明显差别，否则，需加入其它试剂（如显色剂、酶试剂等），将其转变成可测物质，但必须专虑到加入的酶试剂或显色剂对待测酶是

否有影响。

3通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法称为平衡法。用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与反应时间不成线性，故不

能把〔p〕或〔s〕 的总变化量除以t来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平衡法也会受到产物抑制、可逆 反应等因素的影响，由于反应时间较定时法更长，故这种影响

会更大，测定结果也较连续监 测法低，不能代表初速度，也不是零级反应的速度。但是与定时法相同，只要待测标本与正常标本在相同条件下反应并测定，亦能以此判断出

待测标本酶活力的相对大小。而且，对于有些零级反应期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。

抽提蛋白质时，哪些因子可影响抽提的效率

（1）pH值改变溶质解离状态。 对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般选择抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。通常碱性蛋白质选用低pH值的溶

液抽提，酸性蛋白质选用高pH值的溶液抽提，或者用调至一定pH值的有机溶剂抽提。

（2）溶剂的极性和离子强度 有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关

（相似相溶原理）；离子强度通过影响溶质的带电性也影响溶质的溶解度。

一般离子强度较低的中性盐溶液可促进蛋白溶解（盐溶），高离子强度的中性盐可引起蛋白质沉淀，析出（盐析）。高离子强度使DNA溶解度增加；低离子强度使RNA

溶解度增加（核酸分离依据）。

（3）水解酶 细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，会导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。为此，必须采用加入抑制剂，调节

抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶丧失活性

（4）温度 提高温度，溶解度增加，但易使大分子物质变性失活。小分子物质：50～70℃；生物大分子：0～10℃，最好控制在0～4℃

（5）搅拌 搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法 ，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活。

（6）氧化 一般蛋白质都含相当数量的巯基，该基团常常是酶和蛋白质的必须基团，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶

（或蛋白质）失活（或变性）。在提取液中加入巯基乙醇，半胱氨酸。还原性谷胱甘肽等还原剂，可防止巯基发生氧化，使蛋白，酶失活。

（7）金属离子 蛋白质的巯基除易受氧化剂作用外，还能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。

（8）抽提液与抽提物的比例 在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以5∶1为宜。

概述对提取物进行浓缩的常用方法

1. 盐析法 用添加中性盐的方法来使某些蛋白质（或酶）从稀溶液中沉淀出来，从而达到样品浓缩的目的。最常用的中性盐是硫酸铵，其次是硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫

酸钾等。

2. 有机溶剂沉淀法 在生物大分子的水溶液中，逐渐加入乙醇、丙酮等有机溶剂，可以使生物大分子物质的溶解度明显降低，从溶液中沉淀出来，这也是浓缩生物样品的常用

方法。其优点是溶剂易于回收，样品不必透析除盐。在低温条件下用有机溶剂沉淀法得到的多种生物大分子可保持生物活性，但某些蛋白质或酶易变性失活，应小心操作。

3. 葡聚糖凝胶浓缩法 向稀样品溶液中加入干的葡聚糖凝胶（Sephadex）G-25，缓慢搅拌30 min，葡聚糖凝胶吸水膨胀，进行吸滤，生物大分子全部留在溶液中，如此重复

数次，可在短时间使溶液浓缩，每次葡聚糖凝胶的加入量为溶液量的1/5为宜，用过的葡聚糖凝胶经去离子水洗净后，用乙醇脱水干燥后可重复使用。

4. 聚乙二醇浓缩法 将待浓缩液装放入透析袋内，袋外复盖聚乙二醇，袋内的水分很快被袋外的聚乙二醇所吸收，在极短时间内，可以浓缩几十倍至上百倍。被溶剂饱和的

聚乙二醇经加热除去溶剂后可再次使用。

5. 超滤浓缩法 适用于生物大分子的浓缩或脱盐，并具有不存在相变、不添加任何化学物质、成本低、操作方便、条件温和、回收率高等优点。通过超滤法，蛋白质和酶的稀

溶液一般可浓缩到10％～50％浓度，回收率高达90％。应用超滤法的关键是根据实验需要选择合适的滤膜和超滤装置。

膜板式超滤装置，截留面积有限。中空纤维超滤在一支空心柱内装着许多的中空纤维毛细管，管的内径一般在0.2 mm左右，极大地增加了渗透的表面积，提高了超滤的

速度。通过蠕动泵或液压泵将待超滤液注入中空纤维管内，小分子和溶剂被挤出管外，大分子逐步被浓缩，同时可以去除小分子和盐分。

6. 常压蒸发法 蒸发是溶液表面的水或溶剂分子获得的动能超过溶液内分子间的吸引力以后，脱离液面进入空间的过程。在常压下加热使溶剂蒸发，溶液被浓缩称常压蒸

发。该法操作简单，但仅适于浓缩耐热物质。

本文标签： 反应溶液测定分子离子