助力科研基金申请:微生物组测序分析步骤和预算模板

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2024年4月7日发(作者：)

助力科研基金申请：微生物组测序分析步骤和预算模板

微生物组测序分析包括菌群结构谱、宏基因组和宏转录组，但是

目前宏转录组研究较少。所以，本文介绍菌群结构谱、宏基因组测序

分析的主要步骤和预算，以助大家申请相关科研基金。

本文介绍三种模式：（1）单独的菌群结构谱，即只研究菌群种类

和丰度，该模式的特点是所需资金少，但研究的深度浅；（2）单独的

宏基因组，研究菌群种类和丰度的同时，研究菌群所携带的基因的功

能和丰度，该模式的特点是研究的深度深，但所需资金多而且风险较

大；（3）菌群结构谱+宏基因组，该模式的特点是先投入较少的资金

较大范围的筛选样品，然后从中挑出某些样本投入较多的资金深入研

究，实现较深研究深度的同时规避风险。

如有疑问或想和深圳微生太科技有限公司合作，可以联系江舜尧。

电话：133****0601，微信133****0601或173****9151。

第一部分 步骤和预算

第一种模式：单独的菌群结构谱

1.1 步骤：

① 利用菌群采样器（或其他工具，如冻存管）采集待测样本（如

果样本是人类粪便，建议使用菌群采样器采样，详细信息点击：一种

基于菌群采样器的粪便菌群采样方法）；

② 使用宏基因组 DNA 提取试剂盒提取样本（如粪便）中的总

DNA；

③ 以细菌16S rRNA 基因的V3～V4可变区序列为靶标，以带有

barcode 序列的338F-806R为引物（或其他靶标和引物，见表1），

进行 PCR 扩增，获取 PCR 产物；

表1 各种引物及其序列

测序类

型

细菌

16S

rRNA

引物名称

515F

907R

引物序列

5'- GTGCCAGCMGCCGCGG-3'

5'- CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'

392bp

长度

测序平台

PE250平

台，土壤等

环境样本推

荐使用

细菌

16S

rRNA

338F

806R

ITS5F

真菌IT

S

ITS1R

5'- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'

5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'

5'- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG

5'- GCTGCGTTCTTCATCGATGC

468bp

PE300平

台，粪便等

样本推荐使

用

PE250平

台，欲获得

300bp左右

较丰富的种

类者推荐使

用

547F

真菌

18S

V4R

5'- CCAGCASCYGCGGTAATTCC

5'- ACTTTCGTTCTTGATYRA

420bp

，欲获得较

准确的种类

者推荐使用

PE300平台

④ PCR 产物经过定量及文库构建后，利用 Illumina MiSeq

PE300平台（根据实际情况调整）进行高通量测序，获取细菌16S

rRNA 基因的V3～V4 可变区碱基序列信息（根据实际情况调整）；

⑤ 利用 QIIME 软件，对测序序列进行质控及 OTU（分类学操作

单元）聚类，OUT代表序列与Greengenes数据库（或其他数据库，

见表2）进行比对分析，获取 OTU 对应的分类单元（包括门纲目科属

种）及其相应的丰度信息；

表2 各序列比对数据库

测序基因

16S rRNA

18S rRNA

ITS

建议比对数据库

Greengenes

Silva

RDP

Silva

UNITE

/

数据库网址

/

/

⑥ 计算 Chao1、ACE、Shannon 和 Simpson 等度量指数，评

估样品中细菌菌群的丰富度和均匀度；

⑦ 综合应用 PCA 分析、Metastats 分析、LEfSe 分析、ANOVA

方差分析等方法寻找各组样品中的特征菌；

⑧ 应用 RDA 分析关联菌群结构和环境因子（如动物生理生化指

标），寻找与环境因子（或动物病理生理特征）存在正相关或负相关

的菌群；

⑨ 应用PICRUSt 软件，预测各组样本菌群的代谢功能，从中找

出有差异的组分。

1.2 预算：X*550元／例=Y元。建议单价按550-500元预算，样

本多时，单价偏低，样本少时，单价偏高。该预算比市场价高，这样

做是为了不至于被动。

表3 菌群结构谱测序分析预算明细

实验步骤

DNA提取

PCR扩增

文库构建

测序

数据分析

单价（元）

50

100

80

200

120

共计（元）

样本数

X

X

X

X

X

总价（元）

50X

100X

80X

200X

120X

550X

注：

① 如果不是按550元做预算，记得调整明细。

② 如果样本是人类粪便，建议增加菌群采样器的预算，每份样本

用一个采样器，单价为55-50元（该预算比市场价高）。

③ 本预算按照从DNA提取到数据分析全外包的模式，这样外协

检测费在标书总预算中会占比较高。如果一定要降低检测费比例，标

书中做预算时可以将DNA提取费做成购买DNA提取试剂盒的费用，

如美国Omega菌群DNA提取试剂盒，2000元／盒，50次装（即理

论上可以提取50份样品）。此部分可以加倍预算，即，如果需要提取

100份样本，可以预算购买4个50次装的试剂盒。

第二种模式：单独的宏基因组

2.1 步骤：

① 利用菌群采样器（或其他工具，如冻存管）采集待测样本（如

果样本是人类粪便，建议使用菌群采样器采样，详细信息点击：一种

基于菌群采样器的粪便菌群采样方法）；

② 使用宏基因组 DNA 提取试剂盒提取样本中的总 DNA；

③ 总 DNA 经过随机打断，连接接头和PCR扩增富集等处理，构

建测序文库；

④ 利用 Illumina HiSeq 4000高通量测序平台进行宏基因组测序，

获得样品宏基因组序列；

⑤ 测序原始数据质控后利用 SOAP denovo 组装软件进行组装，

再利用 MetaGeneMark 软件进行 ORF（Open Reading Frame，开

发阅读框）预测，经 CD-HIT 软件去冗余后获得非冗余基因集，采用

SoapAligner 软件，综合应用各样本的测序数据，获得各样品中各基

因的丰度表；

⑥ 从非冗余基因集出发，与 NCBI 的 NR 数据库进行比对，获得

基因的物种注释信息，及物种丰度表；

⑦ 从非冗余基因集出发，进行代谢通路(KEGG)，同源基因簇

(eggNOG)，碳水化合物酶(CAZy)的功能注释和丰度分析，获得基因

功能丰度表；

⑧ 基于物种丰度表和功能丰度表，进行丰度聚类分析、PCA 分析、

样品聚类分析、显著性差异分析（包括Metastats 和LEfSe）、代谢

通路比较分析，挖掘各组样本之间的物种组成和功能组成差异，为进

一步深入研究xxxxx提供支撑。

2.2 预算：Z*5500元／例=W元。建议单价按5500-5000元预

算，样本多时，单价偏低，样本少时，单价偏高。该预算比市场价高，

这样做是为了不至于被动。

表4 宏基因组测序分析预算明细

实验步骤

DNA提取

文库构建

测序

数据分析

单价（元）

200

600

900

3800

共计（元）

样品数

Z

Z

Z

Z

总价（元）

200Z

600Z

900Z

3800Z

5500Z

注：

① 如果不是按5500元做预算，记得调整明细。

② 如果样本是人类粪便，建议增加菌群采样器的预算，每份样本

用一个采样器，单价为55-50元（该预算比市场价高）。

③ 本预算按照从DNA提取到数据分析全外包的模式，这样外协

检测费在标书总预算中会占比较高。如果一定要降低检测费比例，标

书中做预算时可以将DNA提取费做成购买DNA提取试剂盒的费用，

如美国Omega菌群DNA提取试剂盒，2000元／盒，50次装（即理

论上可以提取50份样品）。此部分可以加四倍预算，即，如果需要提

取100份样本，可以预算购买8个50次装的试剂盒。

第三种模式：菌群结构谱+宏基因组

3.1 步骤：

3.1.1 菌群结构谱部分：

① 利用菌群采样器（或其他工具，如冻存管）采集待测样本（如

果样本是人类粪便，建议使用菌群采样器采样，详细信息点击：一种

基于菌群采样器的粪便菌群采样方法）；

② 使用宏基因组 DNA 提取试剂盒提取样本（如粪便）中的总

DNA；

③ 以细菌16S rRNA 基因的V3～V4可变区序列为靶标，以带有

barcode 序列的338F-806R为引物（或其他靶标和引物，见表1），

进行 PCR 扩增，获取 PCR 产物；

表1 各种引物及其序列

测序类

型

细菌

16S

rRNA

细菌

16S

rRNA

真菌IT

引物名称

515F

907R

338F

806R

ITS5F

引物序列

5'- GTGCCAGCMGCCGCGG-3'

5'- CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'

5'- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'

5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'

5'- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG

468bp

392bp

长度

测序平台

PE250平

台，土壤等

环境样本推

荐使用

PE300平

台，粪便等

样本推荐使

用

300bp左右

PE250平

S

ITS1R

5'- GCTGCGTTCTTCATCGATGC

台，欲获得

较丰富的种

类者推荐使

用

547F

真菌

18S

V4R

5'- CCAGCASCYGCGGTAATTCC

5'- ACTTTCGTTCTTGATYRA

420bp

PE300平台

，欲获得较

准确的种类

者推荐使用

④ PCR 产物经过定量及文库构建后，利用 Illumina MiSeq

PE300平台（根据实际情况调整）进行高通量测序，获取细菌16S

rRNA 基因的V3～V4 可变区碱基序列信息（根据实际情况调整）；

⑤ 利用 QIIME 软件，对测序序列进行质控及 OTU（分类学操作

单元）聚类，OUT代表序列与Greengenes数据库（或其他数据库，

见表2）进行比对分析，获取 OTU 对应的分类单元（包括门纲目科属

种）及其相应的丰度信息；

表2 各序列比对数据库

测序基因

16S rRNA

18S rRNA

ITS

建议比对数据库

Greengenes

Silva

RDP

Silva

UNITE

/

数据库网址

/

/

⑥ 计算 Chao1、ACE、Shannon 和 Simpson 等度量指数，评

估样本中细菌菌群的丰富度和均匀度；

⑦ 综合应用 PCA 分析、Metastats 分析、LEfSe 分析、ANOVA

方差分析等方法寻找各组样本中的特征菌；

⑧ 应用 RDA 分析关联菌群结构和环境因子（如动物生理生化指

标），寻找与环境因子（或动物病理生理特征）存在正相关或负相关

的菌群；

⑨ 应用PICRUSt 软件，预测各组样本菌群的代谢功能，从中找

出有差异的组分，为深入挖掘菌群的功能、剖析作用机制做铺垫。

3.1.2 宏基因组部分：

① 通过上述菌群结构谱的研究，筛选出关键节点的样本，进行宏

基因组测序，以深入挖掘菌群的功能，并剖析作用机制，具体为：

② 使用宏基因组 DNA 提取试剂盒提取样本中的总 DNA；

③ 总 DNA 经过随机打断，连接接头和PCR扩增富集等处理，构

建测序文库；

④ 利用 Illumina HiSeq 4000高通量测序平台进行宏基因组测序，

获得样本宏基因组序列；

⑤ 测序原始数据质控后利用 SOAP denovo 组装软件进行组装，

再利用 MetaGeneMark 软件进行 ORF（Open Reading Frame，开

发阅读框）预测，经 CD-HIT 软件去冗余后获得非冗余基因集，采用

SoapAligner 软件，综合应用各样本的测序数据，获得各样本中各基

因的丰度表；

⑥ 从非冗余基因集出发，与 NCBI 的 NR 数据库进行比对，获得

基因的物种注释信息，及物种丰度表；

⑦ 从非冗余基因集出发，进行代谢通路(KEGG)，同源基因簇

(eggNOG)，碳水化合物酶(CAZy)的功能注释和丰度分析，获得基因

功能丰度表；

⑧ 基于物种丰度表和功能丰度表，进行丰度聚类分析、PCA 分

析、样本聚类分析、显著性差异分析（包括Metastats 和LEfSe）、

代谢通路比较分析，挖掘各组样本之间的物种组成和功能组成差异，

为进一步深入研究xxxxx提供支撑。

3.2 预算：即菌群结构谱和宏基因组的总和。但是菌群结构谱的样

本数大于宏基因组的，两者可以大概按照5:1的比例计算。明细见以下

两个表格。

表3 菌群结构谱测序分析预算明细

实验步骤

DNA提取

PCR扩增

文库构建

测序

单价（元）

50

100

80

200

样品数

X

X

X

X

总价（元）

50X

100X

80X

200X

数据分析

120

共计（元）

X

120X

550X

表4 宏基因组测序分析预算明细

实验步骤

DNA提取

文库构建

测序

数据分析

单价（元）

200

600

900

3800

共计（元）

样品数

Z

Z

Z

Z

总价（元）

200Z

600Z

900Z

3800Z

5500Z

注：

① 如果不是按550元和5500元做预算，记得调整明细。

② 如果样本是人类粪便，建议增加菌群采样器的预算，每份样本

用一个采样器，单价为55-50元（该预算比市场价高）。

③ 本预算按照从DNA提取到数据分析全外包的模式，这样外协

检测费在标书总预算中会占比较高。如果一定要降低检测费比例，标

书中做预算时可以将DNA提取费做成购买DNA提取试剂盒的费用，

如美国Omega菌群DNA提取试剂盒，2000元／盒，50次装（即理

论上可以提取50份样品）。菌群结构谱部分，此部分可以加倍预算，

即，如果需要提取100份样本，可以预算购买4个50次装的试剂盒；

宏基因组部分，此部分可以加四倍预算，即，如果需要提取100份样

本，可以预算购买8个50次装的试剂盒。

第二部分 基础知识

一 结题报告模板

本文标签： 菌群样本测序