电子直线加速器照射对NIH 3T3细胞的细胞周期及凋亡的影响

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2024年3月10日发(作者：)

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１３０　ＳＵＺＨＯＵ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ　２００２；２２（２）　

电子直线加速器照射对ＮＩＨ　３Ｔ３细胞的细胞周期及凋亡的影响　

徐　岚周迎会　史　宁　彭　淼　吴士良　

（苏州大学生物化学与分子生物学教研室．苏州２１５００７）　

摘要：目的探讨电子直线加速器照射对细胞周期及细胞凋亡的影响。方法　采用直线加速器对ＮＩＨ　３Ｔ３　

细胞进行照射．观察细胞周期及细胞凋亡的改变情况；同时测定损伤前后ｐ５３蛋白的表达情况　结果照射后细　

胞谓亡数增加．ｐ５３蛋白表达量上升。结论电子直线加速器照射损伤可诱导细胞凋亡。　

关键词：电子直线加速器；放射损伤；细胞凋亡　

中圉分类号：Ｒ８１８　７４文献标识码：Ａ文章编号：１０００—５７４９（２００２）０２—０１３０—０３　

Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｆｔｅｒ　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　

Ｌｉｎｅａｒ　Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ　Ｉｎｊｕｒｙ　

ＸＵＬａｎ．ＺＨＯＵＹｉｒｔｇ—ｈｕｌ，ＳｉｌｌＮｉｎｇ，“ａｌ　

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｓｕｚｈｅｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｕｚｈｏｕ　２１５００７，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｕｒｐｌｅ　Ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｊｕｒｉｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ　

ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｌｉｎｅａｒ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＮＩＨ　３Ｔ３　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｅｈ　

ｅｌｅｃｔｒｏｎ　１ｉｎｅａｒ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ．Ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌ１　ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎ—　

ｊｕｒｉｅｄ　ｃｅ１ｌｓ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　０ｆ　ｐ５３　Ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｔｅｓｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｆｔｅｒ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｏ　ｒａｄｉａ—　

ｔｉｏｎ．ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ａｐｏｐｔｏｔｉｅ　ｃｅｌｌｓ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｔｅｈ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐ５３　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｅｌｅｃ・　

ｔｒｏｎ　１ｉｎｅａｒ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ　ｃａｎ　ｉｎｄｕｃｅ　ｃｅｌ１　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｅｌ￣ｔｒｏＩ１　ｌｉｎｅａｒ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ；ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｉ　ｕｒｙ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　

肿瘤患者直线加速器放疗的副作用之一是易发　

１．１材料ＮＩＨ　３Ｔ３成纤维细胞由苏州大学生物　

生皮肤损伤；核燃料生产或辐射研究中由于核事故　

技术系细胞免疫中心提供。鼠抗人ｐ５３蛋白　

或防护疏忽亦会产生皮肤损伤。直线加速器照射损　（ＤＡＫＯ）、羊抗鼠ＩｇＧ—ＨＲＰ（ＳＡＢＣ）．均购自上海　

伤机理的研究对于核辐射损伤的治疗及防止恶变有　

化学试剂商店。　

一

定理论意义，同时可为临床提高辐射救治水平提　

１　２研究方法　

供理论和实践依据。　

１．２．１实验细胞的处理Ｐｈｉｌｉｐｓ　ＳＬ　１８型直线加　

目前．国内外对辐射皮肤损伤的研究发觋．重度　

速器照射对数生长期的ＮＩＨ　３Ｔ３细胞．剂量率为　

烧伤患者晚期极易恶变，引发皮肤癌…。这个问题　２Ｇｙ／ｍｉｎ．分对照组（０Ｇｙ），５Ｇｙ组，１０Ｇｙ组及１５Ｇｙ　

是近年的研究热点．它是否与细胞凋亡有关？与原　

组，照射后继续培养．次日胰酶消化处理．收取细胞　

癌基因和抑癌基因的表达突变有关？与损伤修复有　及其上清液．置一２０＂（２。进行各项指标测定前，将细　

关？国内外对这方面的研究报道不多。本研究采用　胞用含Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００的细胞裂解液处理。　

直线加速器照射ＮＩＨ　３Ｔ３成纤维细胞．观察细胞周　

１　２　２流式细胞仪分析细胞周期与细胞凋亡经　

期变化及细胞凋亡情况。现报道于下。　

辐照处理过的ＮＩＨ　３Ｔ３细胞．用胰酶消化处理．制　

成单细胞悬液．７０％预冷乙醇固定过夜．调整细胞浓　

１材料和方法　

度为１×１０　／ｍ１．采用流式细胞仪分析细胞周期及凋　

基金项目：国防科工委国防预研课题（编号Ｙ６９２００２６—０４）　

收稿日期　２００１—１２—１０作者简升：撩￣（１９６４一）　女．江苏射阳人．主管技师　主要从事生物化学厦分子生物学研究　

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苏州大学学报（医学版）２００２；２２（２）　１３ｌ　

亡情况。大致操作步骤为：洗去乙醇，加入含　

１００ｔ，ｇ／ｍｌ　Ｒｎａｓｅ，５０ｖａ／ｍｌ　ＰＩ（Ｐｍｐｉｄｉｕｍ　Ｉｄｏｄｉｄｅ．碘　

化丙啶），０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００的染色液，室温避光　

３０ｍｉｎ．流式细胞仪检测。ＰＩ用４８８ｎｍ氩离子激光　

抗结合，３７℃下２ｈ后，充分漂洗，显色。　

２结果　

２　ｌ　辐射对细胞周期及凋亡的影响见图ｌ。从　

激发，６７５ｎｍ滤光片检测，Ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｅ软件分析，计　

算“亚Ｇ１”峰的ＤＮＡ含量：ＡＰ（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｐｅａｋ．凋　

亡峰）Ｉｎｄｅｘ＝ＡＰ　ｃｈａｎｎａｌ／Ｇｔ　ｃｈａｎｎａｌｏ　

１．２．３　Ｗｅｓｔｅｍ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ测定ｐ５３蛋白表达情况　

图ｌ可见，细胞大部分（主峰）处于Ｇｏ／Ｇ。期．在主　

峰之前的小峰为凋亡细胞，辐照影响细胞凋亡的情　

况为：５Ｇｙ照射后凋亡细胞略有减少，而处于　／Ｇ　

期的细胞数目增加．从低于２００升至２３０左右．　

ｔ０Ｇｙ、１５Ｇｙ照射后凋亡细胞呈上升趋势，　／Ｇ１期　

参照Ｊ．Ｓａｍｂｒｃｏｋ方法＿２　Ｊ进行。细胞裂解液用ＳＤＳ　

—

ＰＡＧＥ平板电泳４～５ｈ，漂洗后以ＮＣ膜作电泳转　的细胞有所减少，降至１６０以下。　

移（伯奥进口分装ＮＣ膜，Ｔｒｉｓ—Ｃｌｙ含甲醇缓冲　

２．２　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析辐射对ＮＩＨ　３Ｔ３细胞表　

渡），５０ｍＡ电场中转移４ｈ。转移后的ＮＣ膜置含脱　

达ｐ５３的影响　３蛋自在ＮＩＨ　３＂／＇３细胞中有少量　

脂奶粉、防沫剂Ａ和迭氮钠的封闭液中封闭，３７℃　表达，而辐照后表达量上升，表达情况次序为：１５Ｇｙ　

下ｌｈ后，漂洗。一抗结合，３７℃下２ｈ后，漂洗。二　

组＞１０Ｇｙ组＞５Ｇｙ组（图２）。　

簌　

鲁　

器　

０　６４　１２８　１９２　２５６　３２０　３８４　４４８　５１１　

ＤＮＡ古量　ＤＮＡ古量　

０Ｄｒ　

５Ｇｙ　

ＤＮＡ含量ＤＮＡ古量　

１０Ｇｙ　ｔＳＧｙ　

圈１　细胞周期和细胞捅亡的流式细胞仪分析　

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１３２　ＳＵＺＨＯＵ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＪＯＵＲＮＡｌ　ＯＦ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ　２００２

；２２（２）　

ＯＧｙ　５Ｇｙ　５Ｇｙ　１０Ｇｙ　１５Ｇｙ　

图２　ｐ５３蛋白表达的印迹分析　

３讨论　

ＤｉＢｉａｓｅ　ＳＪ．Ｇｕａｎ　Ｊ．Ｃｕｒｒａｎ、ｖＪ　Ｊｒ，ｅｔ　ａｌ　Ｒｅｐａｉｒ　ｏｆ　ＤＮＡ　

ｄｏｕｂｌｅ—ｓｔｒａｎｄ　ｂｒｅａｋｓ　ａｎｄ　ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｋｉｌｌｉｎｇ　ｉｎ　ａｎ　

本实验结果表明，直线加速器照射损伤能诱导　

ｉｓｏｇｅｎｉｅ　ｇｒｏｕｐ　ｏｆ　ｐ５３　ｍｕｔａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ［Ｊ］．１ｎｔ　Ｊ　Ｒａｄｉａｔ　

细胞凋亡，且在一定剂量范围内凋亡诱导情况与辐　

Ｏｎｏｏｌ　Ｂｉｄ　Ｐｈｙｓ．１９９９．４５（３）：７４３～７４５１　

射剂量成正相关。辐照后，处于Ｇｏ／Ｇ　期的细胞数　

Ｍａｔｈｉｅｕ　Ｊ．Ｒｉｅｈａｒｄｓ　Ｓ．Ｂａｌｌｅｓｔｅｒ　Ｂ，ｅｔ　ａ１　Ａｐｏｐｔｃ￣ｉｓ　ａｎｄ　

有上升趋势，这与ＤＮＡ损伤后ｐ５３基因诱导细胞　

ｇａｍｍａ　ｒａ　［Ｊ］．Ａｎｎ　Ｐｈａｒｍ　Ｆｒ．１９９９．５７（４）：３１４￣３２３　

Ｋａｗ￣ｈｉｍａ　Ｍ，Ｈａｓｅｇａｗａ　Ｍ，Ｈａｙａｋａｗａ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ　

周期在Ｇ１期的阻滞或诱导凋亡的报道＿３・　相符。　

ｏｆ　ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ　ｅｔｒａｅｔｍｅｎｔ　ｏｎ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐ５３一　

损伤引起细胞凋亡的调控如何？有报道认为，至少　

ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｐｏｐｔｏｓｋｓ［Ｊ］Ａｎｔｉｃｅｍｅｅｒ　Ｒｅｓ，１９９９，１９（６Ｂ）：　

有３个蛋白在辐射诱导凋亡的调节中起作用，即　

５１０１～５１１０　

ｐ５３，Ｆａｓ，Ｂｃｌ～２［　。另有报道【　肯定了ｐ５３对　

Ｌａｋｉｎ　ＮＤ，Ｊａｃｋｓｏｎ　ＳＰ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ５３　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　

辐射诱导凋亡的作用。有人＿ｌ　更深入地研究了在　

酣　铂　

ＤＮＡ　ｄａｍａｇｅ［Ｊ］Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９９，１８（５３）：７６４４－－７６５５　

此过程中Ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１的作用。本实验以Ｗｅｓｔｅｍ　

Ｓ。Ｔ１ｇ　Ｓ，Ｌａｍｂｅｒｔ　ＰＦ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｏｆ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　

ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ｐ５３蛋自的表达情况，从结果可以初步　

ｎａｄ　ｈａｉｒ　ｆＤｌｌｉｃｕｌ￣ｒ　ｅｅｌＩｓ　ｔｏ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｃｏｒｚｅｌａｔｅ　ｗｉｔｈ　ｄｉｓｆｉｎｔ　

认为，直线加速器照射损伤可以激活ｐ５３基因上调　

ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ｐ５３　ａｎｄ　ｐ２１　ｉｎｄｕｃｔｉｏｔｔ［Ｊ］Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ，　

表达ｐ５３蛋白。是否就是ｐ５３蛋白发挥功能，促进　

１９９９，１５５（４）：１１２１～１１２７　

Ｓｈａｎｋａｒ　Ｂ．Ｐｒｅｍａｃｈａｎｄｒａｎ　Ｓ．Ｂｈａｒａｍｂｅ　ＳＤ，ｅｔ　ａｌ　

ＤＮＡ的修复或诱导未能修复的细胞凋亡？若是，则　

Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｐｏｒｔｓｅ　ｂｙ　ｌｏｗ　ｄｏｓｅ　ｉｏｎｉｚｉｎｇ　ｒａ—　

具体机制如何？是否还有其他调控关系？这些都有　

ｄｉａｔｉｏｎ：ｒｏｌｅ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｓｉｓ［Ｊ］Ｉｍｍｕｎｏ［Ｌｅｔｔ．１９９９，６８（２　

待于进一步研究。　

—

３）：２３７～２４５　

参考文献：　

Ｍａ１］ｙａ　ＳＭ，Ｓｉｋｐｉ　ＭＯ．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ　ｆｏｒ　ｐ５３　ｉｎ　ｉｏｎｉｚｉｎｇ　

—ｒａｄｉａｔｉｏｎ—ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｏｕｂｔｅ—ｓｔｒａｎｄ—ｂｒｅａｋ｜ｅ—　

［１］翁志根　皮肤放射损伤研究的现状和展望［Ｊ］中华放　ｊｏｉｎｉｎｇ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　ｌｙｍｐｈｏｂｔａ￣ｔｓ［Ｊ］Ｍｕｔａｔ　Ｒｅｓ．１９９９，　

射医学与防护杂志．１９９６，１６（４）：２１８－－２２０　

４３４（２）：１１９～１３２　

［２］Ｓａｍｂｒｃ￣ｋ　Ｊ，Ｆｒｉｒｓｃｈ　ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．分子克隆实验指　

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南［Ｍ］．第２版北京：科学出版社．１９９３：８８８－－８９７　

ｄｕｃｅｄ　ｐ５３　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ　ａｒｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　

［３］Ａｌｌａｎ　ＬＡ．ＦｒｉｅｄＭ．ｐ５３一ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　

—

ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ［Ｊ］Ｃｕｔａｎ　Ｍｅｄ　Ｓｕｒｇ，１９９９，３（５）：２８０～　

ａＩＴｏ．￣ｔ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｏｒｍｓ　ｏｆ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｕ２０Ｓ　

２８３　

ｃｅｌｌｓ：ｐ２１　ＷＡＦｌ／ＣｌＰ　１　ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ＵＶ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐ—　

［１２］　

Ｈｉｙａｍａ　Ｈ．Ｒｅｅｖｅ￣ＳＡ　Ｒｏｌｅｓ　ｆｏｒ　ｃｙｃｉｉｎ　Ｄ１　ｉｎ　ＵＶＣ—　

ｔｏｓｉｓＥＪ］Ｏｎｏｏｇｅｎｅ，１９９９，１８（３９）：５４０３～５４１２　ｉｎｄｕｅｅｄｅｄ　ａｎｄ　ｐ５３一ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓ￣［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　

Ｄｉｆｅｒ，１９９９，６（６）：５６５－－５６９　

本文标签： 细胞凋亡照射损伤直线