利用RAPD技术探讨延边苹果梨的分类地位

维普资讯

第２４卷

２００２年９月　

第３期　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　

延

Ａｇｒｉ

边

ｃｕｌ

大

ｔｕｒａｌ

学

　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｙａｎｂｉ

农学学

ａｎ　Ｕｎｉ

报　

ｖｅｒｓｉｔｖ　Ｖｏ１．２４　Ｎｏ．３　

Ｓｅｐ．２００２　

利用ＲＡＰＤ技术探讨延边苹果梨的分类地位　

曲柏宏　，　金香兰　，　陈艳秋　，　刘洪章２，　王丕武２　

（１．延边大学农学院园艺系，吉林龙井１３３４００；２．吉林农业大学生物技术学院，吉林长春１３００００）　

摘要：利用ＲＡＰＤ技术，用筛选的１２个１０　ｂｐ随机引物对梨属４０个材料扩增，着重对其中的　

苹果梨类型进行了分子评价，针对苹果梨分类地位存在的异议，认为延边苹果梨应该归属于白　

梨系统．　

关键词：梨属；苹果梨；ＲＡＰＤ；分类　

中图分类号：￥６６１．２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００４—７９９９（２００２）０３．０１５５．０４　

Ｏ　前言　

苹果梨是梨属中罕见的抗寒优良种质资源，曾有很多学者对其进行了形态学、酶学、孢粉　

学的研究，但一直存有异议．ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ）技术是基于ＰＣＲ的一　

种分子标记，在我国已有了关于应用ＲＡＰＤ技术鉴定苹果、柑橘、桃等果树品种的研究报道．笔　

者采用ＲＡＰＤ技术，对梨属的４Ｏ个品种、杂种、芽变品种进行了分析，本文着重对其中的苹果　

梨进行分子评价，并结合前人的研究，对延边苹果梨的分类地位进行了探讨．　

１材料与方法　

试材名称、编号及来源见表１，其中２２号为苹果梨，采集地为吉林省龙井市老头沟镇小　

箕村苹果梨母树园，其它品种采自中国农业科学研究院果树所国家种质资源梨圃和延边大　

学农学院果树场．　

取供试梨的成熟叶片，采用ＳＤＳ法提取ＤＮＡ．应用筛选的１２个引物（表２）进行ＰＣＲ扩　

增．随机引物购自美国Ｏｐｒｏｎ公司（１０　ｂｐ），Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰｓ均购自北京鼎国生物技术中心．　

扩增条件采用经优化的反应体系，ＰＣＲ反应液总体积为２５　Ｌ，其中含Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ（ｐＨ９．０）１Ｏ　

ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣＩ　５０　ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣＩ，２．０　ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｄｎｔｐ　０．２　ｍｍｏｌ／Ｌ、模板ＤＮＡ　１０　ｎｇ、引物　

８　ｐｍｏｌ、Ｔａｇ酶１．０　Ｕ，其余用ｄｄＨ，Ｏ填充．扩增反应在ＵＮＯ　１１　Ｂｉｏｍｅｔｒａ扩增仪（德国产）上　

进行．反应程序为：９４℃预变性１２０　ｓ，９４℃变性６０　ｓ，３７℃退火７５　ｓ，７２℃延伸１２０　ｓ，共循　

环４０次，最后在７２℃下延伸１０　ｍｉｎ．扩增产物在１．４％琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，　

紫外透射反射仪上观察并拍照．１００　ｂｐＤＮＡ梯度（Ｐｒｏｍｅｇａ，１００～１５００　ｂｐ）用作分子量标准．　

以２次重复出现的扩增带作为统计对象，将ＰＣＲ扩增中出现的清晰的带记为ｌ，不出现的记　

为０，录入计算机Ｅｘｃｅｌ表格中，用ＮＴＳＹＳ—ｐｃ软件进行分析，相似系数采用Ｄｉｃｅ系数，最　

后用ＵＰＧＭＡ方法构建聚类图．　

收稿日期：２００２—０７—２５　基金项目：国家自然科学基金资助项目（３９９６００４９）　

作者简介：曲柏宏（１９６３一），男，吉林长岭人，延边大学农学院园艺系教授，博士．　

维普资讯

１５６　延边大学农学学报　第２４卷　

表１供试的梨品种　

编号和品种　来源　编号和品种　来源　编号和品种　来源　

１谢花甜　

２花盖梨　

３南果梨　

４冻秋子梨　

５延边尖把梨　

６延边大香水　

７延边小香水　

８鸭梨　

９砀山酥梨　

１０栖霞大香水　

１１茌梨　

１２黄县长把梨　

１３金花４号

１４明月梨　

延边　１５黄花梨　

延边　１６长十郎　

延边　１７长寿梨　

延边　１８新星　

延边　１９茄梨　

延边　２０巴梨　

延边　２１日面红　

河北　２２苹果梨　

安徽　２３东宁５号大梨

山东　２４夏嘎　

山东　２５苹博香　

山东　２６锦丰　

金花芽变　２７杂种　

延边　２８像苹果梨　

浙江　２９早香２号　

日本　３０桔蜜　

日本　３１五九香　

日本　３２柠檬黄　

欧洲　３３锦香　

欧洲　３４身不知　

欧洲　３５　１２７５　

不详　３６　１１３１　

苹果梨芽变　３７　２—２３　

苹果梨芽变　３８　２—５５　

苹果梨×博多青　３９甜梨　

苹果梨×茌梨　４０瓢梨　

苹果梨×巴梨　

不详　

香水梨×二十世纪　

京白梨×秋白梨　

鸭梨×巴梨　

不详　

南果梨×巴梨　

不详　

乔马×锦丰　

龙香梨×１５５　

早酥梨×早白梨　

早酥梨×八方梨　

韩国　

朝鲜　

表２　ＲＡＰＤ分析中所用的引物　

引物　

ｏＰＡ～０８　

ｏＰＡ～１０　

ｏＰＡ一１２　

序列（５‘一３‘）　

ＧＴＧＡＣＧＴＡＧＧ　

ＧＴＧＡＴＣＧＣＡＧ　

ＴＣＧＧＣＧＡＴＡＧ　

弓Ｉ物　

ｏＰＢ一０１　

ｏＰＨ一０９　

ｏＰＨ一１８　

序歹Ⅱ（５‘一３‘）　

ＴＴＴＣＧＣＴＣＣＣ　

ＴＧＴＡＧＣＴＧＧＧ　

ＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡ　

弓Ｉ物　

ｏＰＧ一０９　

ｏＰＧ一１４　

ｏＰＩ一１６　

序歹Ｕ（５‘一３‘）　

ＣＴＧＡＣＧＴＣＡＣ　

ＧＧＡＴＧＡＧＡＣＣ　

ＴＣＴＣＣＧＣＣＣＴ　

ｏＰＡ一１８　ＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴ　ｏＰＧ一０１　ＣＴＡＣＧＧＡＧＧＡ　ｏＰＩ一１８　ＴＧＣＣＣＡＧＣＣＴ　

２结果与分析　

２．１不同引物扩增结果　

用筛选的１２个引物对４Ｏ份试材ＤＮＡ扩增，得到１４６条ＲＡＰＤ特征带，其中１４１条为　

多态性带，多态性带百分率为９６．６％，１２个引物对４Ｏ个梨品种的区分率达８３．３％～　

１００％．引物ＯＰＨ一０９扩增的ＲＡＰＤ产物图谱如图１．有１Ｏ个品种产生了ＲＡＰＤ特异带，但　

苹果梨没有ＲＡＰＤ特异带，说明苹果梨没有变异类型．　

ｍ　Ｉ　２　３　４　５　６　７　８　９　１Ｏ　ｌ１　１　２　Ｉ３　Ｉ４　１５　Ｉ　６　Ｉ７　Ｉ　８　Ｉ９　２０　

ｍ　２ｌ　２２　２３　２４　２５　２６　２７　２８　２９　３Ｏ　３１　３２　３３　３４　３５　３６　３７　３８　３９　４Ｏ　

图１引物ＯＰＨ一０９扩增的谱带（品种编号的品种名称见表１）　

维普资讯

第３期　曲柏宏，等：利用ＲＡＰＤ技术探讨延边苹果梨的分类地位　１５７　

２．２　聚类分析　

根据ＤＮＡ扩增结果计算苹果梨与其它梨品种之间相似指数（表３）．可以看出，苹果梨　

与秋子梨系统、白梨系统、砂梨系统和西洋梨品种间的相似指数分别为０．２８１～０．４４２，　

０．３５６－－０．５１５，０．２６７－－０．４８５和０．１９１～０．２８１，表明苹果梨与白梨系统间的亲缘关系最近，　

其次是砂梨系统和秋子梨系统，而与西洋梨间的亲缘关系最远．再从构建的４０个梨品种的　

聚类图（图２）也知，在遗传一致度０．６４５作一接合线划分，苹果梨（２２）首先与其芽变品种　

（２３、２４）和杂交品种（２５、２６、２７）聚在一类后，再与白梨聚在一类，说明苹果梨与白梨的亲缘　

关系十分密切．　

表３苹果梨与其他梨代表品种间的相似系数　

１ｊ｛ｓ　

３Ｏ２９２８３９３８３７３６３５３４柏３３３２３１　２７２６２５２４２３　１０　９　８　７　４　６　３　３　２　２１　２０１９１８１４１７１６１５１３１２１１　１　

图２　引物ＯＰＨ一０９扩增的谱带（品种编号的品种名称见表１）　

ｏ　ｃ．ｏ　。　。　．ｏ　ｏ∞．０　６．ｏ　

３　讨论　

关于苹果梨的起源，荆子然报道，苹果梨是１９５２年由吉林省延边果树调查组发现的，当　

时当地的果农称其为黄梨、青梨、朝鲜梨等，但根据它果形扁圆，向阳面有红晕，远看像苹果，　

近看是梨的特点而定名为苹果梨．原来，苹果梨是１９２１年由崔范斗从朝鲜的江原道北青引　

入的梨接穗，嫁接在当地的山梨上，后来经繁殖、栽培而发展起来的地方品种，现在在龙井市　

（原延吉县）老头沟镇小箕村还保留有８０年生苹果梨母树２株（尚能开花结果）．但是，据考　

察，原引种的朝鲜北青并没有苹果梨，主栽品种是日本梨中较抗寒的今村秋、长十郎和地方　

品种青色梨．青色梨系Ｐｙｒｕｓ　ｕｓｓｕｒｉｅｎｓｉｓ　Ｖａｒ．ｏｖｏｉｄｅａ的自然杂交种，像苹果梨，但它皮色　

青，有特殊香味，贮藏力弱，又不同于苹果梨．　

关于苹果梨的分类地位，多年来一直存有异议．形态学上由于苹果梨既有白梨的某些特　

征，如果实黄绿色，贮藏后呈黄色，阳面具红色晕，叶片渐尖，新梢橙红色等；同时又有砂梨的　

某些特征，如果形扁圆形，萼片脱落间或宿存，叶片多呈卵圆形等．因此，蒲富慎、俞德浚、王　

宇霖等人在著作中将苹果梨归为砂梨系统；后来蒲富慎、吴耕民等人又将其归为白梨系统．　

顾模根据苹果梨的抗寒力明显强于白梨和其起源地北青是朝鲜江原道北部的一个杂交梨产　

维普资讯

１５８　延边大学农学学报　第２４卷　

区，认为它可能是砂梨系统的变种（Ｐ．ｐｙｒｉｆｏｌｉａ　Ｖａｒ．ｏｖｏｉｄａ）与秋子梨（Ｐ．“ｓｓ“ｒｉｅｎｓｉｓ）的自　

然杂交种．　

借助同工酶谱来进行亲缘关系分析，沈允权等对苹果梨与秋子梨、白梨、砂梨、西洋梨同　

工酶谱分析比较，指出其与砂梨关系密切．辛培刚等研究表明，锦丰（苹果梨×慈梨）与白梨　

系统的鸭梨关系密切．林伯年等利用同工酶的研究证明白梨与砂梨各自品种谱带类型极为　

相似，互相交错，不易分开，认为砂梨与白梨应归为一种．　

孢粉学的花粉形态观察可以分析果树的进化程度．邹乐敏等根据花粉形态探讨了梨属　

植物的亲缘关系，结果表明苹果梨花粉纹饰属东方梨型，但其花粉形状多数为近球形，个别　

为长球形，与白梨、砂梨等种、品种花粉形态明显不同，而且有的花粉具沟桥，是较为特殊的　

类型．并且其近圆球形花粉形态特征可以稳定地遗传给后代．黄礼森等根据花粉形态特征认　

为白梨可能是秋子梨与砂梨的天然杂交种．但杨槐俊研究了梨野生种和栽培种的花粉形态　

特征，证明白梨系统、砂梨系统、秋子梨系统的花粉粒大小和孑Ｌ穴特征各不相同．　

ＲＡＰＤ分析可从遗传物质ＤＮＡ本身揭示果树的内在关系．研究表明，苹果梨与白梨系　

统的代表品种鸭梨、砀山酥梨、栖霞大香水的相似指数平均为０．４８８，而与砂梨系统为　

０．３７８，与秋子梨系统为０．３１１．说明苹果梨与白梨的亲缘关系最近．其次，从品种聚类图也　

可以看出，苹果梨与其芽变品种及其杂交种聚类后，首先与白梨系统的代表品种聚类在一　

起，结果与王丙旭的研究结果一致．因此，从分子学角度来看苹果梨在梨属中的分类地位，作　

者认为将其列为白梨系统较合适．　

参考文献：　

［１］　王丙旭．ＲＡＰＤ在梨种质资源亲缘关系和品种鉴定中的应用［Ｄ］．长春：吉林农业大学，１９９８．１—９．　

［２］荆子然．苹果梨的来源与发展［Ｊ］．北方园艺，１９８９，（２）：４２—４６．　

［３］蒲富慎，王宇霖．东北的梨［Ｍ］．上海：科学技术出版社，１９５９．８９—１０９．　

［４］　俞德浚．中国果树分类学［Ｍ］．北京：农业出版社，１９７９．１２２—１４６．　

［５］　王宇霖．落叶果树种类学［Ｍ］．北京：农业出版社，１９８８．１９２—１９３．　

［６］蒲富慎．梨种质资源及其研究［Ｊ］．中国果树，１９８８，（２）：４２—４６．　

［７］　蒲富慎，黄礼森，孙秉钧，等．梨品种［Ｍ］．北京：农业出版社，１９８９．１０１—１０９．　

［８］　吴耕民．中国温带果树分类学［Ｍ］．北京：农业出版社，１９８４．３３—８８．　

［９］　沈允权，李显日，金京国，等．应用过氧化物同工酶对苹果梨亲缘关系的研究［Ｊ］．延边农学院学报，　

１９９２（２）：９１—９３．　

Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ａｐｐｌｅ－ｐｅａｒ　ｉｎ　Ｙａｎｂｉａｎ　ａｒｅａ　ｕｓｉｎｇ　ＲＡＰＤ　ｍａｒｋｅｒｓ　

Ｑｕ　Ｂａｉ—ｈｏｎｇ　，Ｊ　ＩＮ　Ｘｉａｎｇ—ｌａｎ　，ＣＨＥＮ　Ｙａｎ—ｑｉｕ　，ＬＩＵ　Ｈｏｎｇ—ｚｈａｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｐｉ—ｗｕ　

（１．Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｙａｎｂｉａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｏｎｇｊｉｎｇ　Ｊｉｌｉｎ　１３３４００，Ｃｈｉｎａ；　

２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＪｉｌｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　Ｊｉｌｉｎ　１３００００，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：４０　Ｐｙｒｕｓ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｌｅｃｔｅｄ　１　２　１　０一ｍａｒ　ｐｒｉｍｅｒｓ，ｕｓｉｎｇ　ＲＡＰＤ．　

Ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ，Ｐｉｎｇｇｕｏｌｉ　ｗｅｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ａｉｍｉｎｇ　ａｔ　ｔｈｅ　ｅｘｉｓｔｅｎｔ　ｄｅｍｕｒｒａｌ　ｏｎ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｓｔａｔｕｓ　ｏｆ　

ａｐｐｌｅ．ｐｅａｒ，ｗｅ　ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ　ｔｈａｔ　ａｐｐｌｅ—ｐｅａｒ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅｌｏｎｇ　ｔｏ　Ｗｈｉｔｅ—ｐｅａｒ　ｓｙｓｔｅｍ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｙｒｕｓ；ａｐｐｌｅ—ｐｅａｒ；ＲＡＰＤ；ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ